采样：在上述的放置条件下，菊芋块茎大约两天取一次样共取五次，取样时间分别是0d、2d、4d、6d、7d，且取样的生物学重复4次。每次取样后都将所采的菊芋块茎与其所长的芽眼分离，分别将其用研钵加液氮研磨成粉末，放置于-80°C冰箱备用。         

3．2  测定参数及方法

3．2．1  糖分的测定   

准确称量0。5 g样品粉末放于10 mL的离心管中，加2 mL 去离子水并震荡均匀，置于100ºC的水浴锅中煮20 min，反复抽取3次，收集3次所得溶液以提取样品中的可溶性总糖。待溶液冷却后，将煮过的样品用滤纸过滤，收集滤液，再将获得的滤液过0。45 μm的水相滤膜，获得HPLC上样液。用安捷伦1200高效液相色谱（HPLC, Agilent Technologies, PaloAlto, CA, USA）连接糖柱Prevail™ Carbohydrate ES (Alltech, column-W250*4。6 mm 5um)和蒸发光检测器ELSD 3300（Alltech）来测定反应产物中各糖分的含量。根据不同糖分在色谱柱中保留时间长短不同，从而将糖分分离开来。用不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的标准品对应的不同的峰面积来绘制标准曲线。用测样品得到的峰面积根据标准曲线得到糖的浓度。

3．2．2  基因的转录水平测定   

3．2．2．1  提取总RNA   

提取RNA：取的研磨好的样品0。5克，用Trizol法提取，将提取好的RNA用Nanodrop2000检测其浓度与纯度，达标后将提取好的RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，保存于-80℃冰箱中。所用的枪头和离心管为RNase-free的，提取到的总RNA用反转录试剂盒(TaKaRa,D6110A)两步法得到cDNA模板，具体方法参照试剂盒的说明书进行。

3．2．2．2  合成并设计引物

该实验所测的果聚糖代谢酶类，其所对应的基因名称为1-FEH Ⅰ，1-FEH Ⅱ，1-FEH Ⅲ，1-FFT，导出已有的基因编码序列（Coding sequence, CDS）到NCBI菊芋EST数据库中BLAST，用Primer Premier 5。0设计特异引物扩增上述四种基因的CDS全长序列。

表1基因1-FEH Ⅰ，1-FEH Ⅱ，1-FEH Ⅲ，1-FFT，1-SST，PCR的引物

基因名称 引物名称 序列(5'to3') 碱基数

Ht1-FEH 1 qPCR Ht1-FEH 1-F CAGTCGTTTCCAAGGAGCAT 20

qPCR Ht1-FEH 1-R CCGCCTGTGAACCACTTAT 19

Ht1-FEH 2 qPCR Ht1-FEH 2-F TTTGTAACCTGGACTCGG 18

qPCR Ht1-FEH 2-R TACCAATCACGCCCTTCA 18

Ht1-FEH 3 qPCR Ht1-FEH 3-F AATGGTGAACCCGTAATC 18

qPCR Ht1-FEH 3-R CCCACTCACTTAGTAGCG 18

Ht1-FFT qPCR Ht1-FFT-F ACCCGCTTCTTATTGAGT 18

qPCR Ht1-FFT-R TGTATTGCCACGTTTAGTT 19

3．2．2．3  合成cDNA与高保真PCR

采用 Prime Script®1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司）反转录合成cDNA 第一链。利用合成的cDNA 第1链为模板，使用 PrimerSTARTM DNA聚合酶（TaKaRa）酶（TaKaRa公司）进行高保真PCR扩增。文献综述

将所有扩增产物跑1%琼脂糖凝胶电泳，将预计的目的基因片段长度一致的电泳条带切割，用快速琼脂糖凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit,Cat。No。CW2302）进行纯化DNA，并回收。  菊芋块茎休眠过程中的生理生化变化(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96682.html