2。1。2培养基和生长条件

TL1在28 °C条件下的LB液体培养基中进行过夜振荡培养。pEASY-T1-degQ、pNZ8149和pNZ8149- degQ是在37 °C条件下的LB液体培养基中进行过夜振荡培养。培养过程所用氨苄青霉素的工作浓度为100 μg/ml。

2。1。3主要试剂和材料

本实验使用Omega Bio-Tek (GA)的试剂盒进行质粒抽提、基因组DNA的提取、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段和PCR产物的纯化，操作方法依照说明书进行。TA克隆载体pEASY-T1 simple从全式金生物技术有限公司购买。高保真 DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DL2000 Marker、DL5000 Marker、限制性内切酶、RT-PCR Kit均购自Fermentas公司。引物degQF、degQR由上海生工生物有限公司合成，其余实验所用试剂均为国产分析纯。

2。2试验与方法

2。2。1 TL1基因组DNA的提取

使用Omega Bio-Tek (GA)细菌基因组提取试剂盒提取TL1基因组DNA，具体步骤如下：

1。将在-80 °C保存的嗜水气单胞菌TL1取样接种于5 ml LB液体培养基中，加入2。5 μl氨苄青霉素，做好标记，28 °C，170 rpm摇床培养12小时过夜。取菌液到1。5 ml EP管中，12,000 rpm离心1 min，尽量吸净上清，重复直至将5 ml菌液处理完毕。

2。向离心后的菌体沉淀中加入180 μl缓冲液GL，和20 μl Proteinase K（放在-20 °C冰箱保藏），再加入10 μl RNase A，吸打混匀至菌体彻底悬浮，56 °C温水浴10 min。

3。在温水浴之后产物中加入200 μl 缓冲液GB，然后再加200 μl 100%乙醇，用移液枪充分吸打混匀。

4。将吸打混匀的产物加入吸附柱中（吸附柱提前放在收集管之上），12,000 rpm离心2 min，离心结束后弃去废液。

5。加入500 μl缓冲液WA，12,000 rpm离心1 min，离心结束弃去废液。文献综述

6。加入700 μl缓冲液WB（使用前按照说明书加入无水乙醇），12,000 rpm离心1 min，离心结束后弃去废液。

7。重复操作步骤6。

8。将弃去废液的空管12,000 rpm离心2 min，弃去废液。在室温下放置5 min，晾干残余的缓冲液。

9。将晾干的吸附柱放在已灭菌1。5 ml EP管上，加入60 μl灭菌水(灭菌水事先加热到60 °C，用移液枪时要注意不戳破吸附膜)，在室温条件下孵育5 min，12,000 rpm离心2 min。

10。离下液重新吸至吸附柱中，静置孵育5 min，12,000 rpm离心2 min，将洗脱液收集到EP管中。

11。用超微量核酸蛋白测定仪进行浓度测定。

2。2。2 degQ基因的克隆

PCR扩增引物的设计与合成，是根据degQ的全序列设计了两个引物：degQF、degQR。 

degQF：GGATCCATGCGTAAACCTCTTTCTGT

degQR：CCCGGGACGGATCACCAGATAGAGG

degQ基因的扩增与克隆，利用1 μl之前收集的基因组为模板，组成25 μl的PCR体系，在PCR仪中进行28个循环的PCR反应