(三)PNGase Stca的酶学性质研究    6
2.6  重组PNGase Stca最适反应条件的测定    6
2.6.1  实验准备    6
2.6.2  反应体系    7
2.6.3  酶最适pH的测定    7
2.6.4  酶最适温度的测定    7
2.7  重组PNGase Stca底物特异性的测定    7
2.7.1  实验准备    7
2.7.2  反应体系    8
2.7.3  酶促反应研究底物特异性    8
2.8  UPLC检测重组PNGase Stca酶对底物的去糖基化作用    8
2.8.1  N-糖链的纯化    8
2.8.2  2-AB标记    8
2.8.3  色谱分析    9
（四）PNGase Stca基因的定点突变实验    9
2.9  PCR扩增目的基因    9
2.9.1  PCR反应体系    9
2.9.2  引物    9
2.9.3  PCR反应程序    10
2.9.4  突变基因的酶切筛选    10
2.9.5  转化与测序    10
2.10  获得重组E.coli BL 21细胞    11
2.10.1  重组E.coli TOP 10细胞的纯化培养    11
2.10.2  质粒的提取    11
2.10.3  重组质粒的转化    11
2.11  突变基因编码PNGase Stca的酶学性质研究    11
3  结果分析    12
3.1  重组PNGase Stca基因诱导表达产物的SDS-PAGE分析    12
3.2  UPLC色谱分析结果    12
3.2.1  pH值对重组PNGase Stca酶活性的影响    12
3.2.2  温度对重组PNGase Stca酶活性的影响    13
3.2.3  UPLC检测重组PNGase Stca酶对不同底物的去糖基化作用    14
4  结论    17
致谢    18
参考文献    18
图3-1 SDS-PAGE电泳结果    12
图3-2 不同pH对重组PNGase Stca酶活性的影响    13
图3-3 不同温度对重组PNGase Stca酶活性的影响    13
图3-4 重组PNGase Stca及PNGase F与RNase B作用酶解产物的UPLC结果    14
图3-5 重组PNGase Stca及PNGase F对Lactoferrin酶解产物的UPLC结果    15
图3-6 重组PNGase Stca及PNGase F对HRP酶解产物的UPLC结果    16
图3-7 重组突变型和野生型PNGase Stca与HRP作用酶解产物的UPLC结果    17

表2-1 SDS-PAGE凝胶组成    6
表2-2 CIT缓冲液组成    6
表2-3 PNGase Stca酶反应体系    7
表2-4 PNGase Stca及PNGase F酶促反应体系组成    8
表2-5 PCR反应体系组成    9
表2-6 PNGase Stca基因定点突变PCR反应引物    10
表2-7 定点突变基因PCR反应程序    10
 新型N-糖酰胺酶PNGase Stca的克隆表达与特性研究
糖蛋白上的糖链在细胞识别、信号转导、分化发育、免疫应答等多种生命活动中起着重要的生物学作用[1, 2]，因此糖链的研究对于生理学和医学领域的发展十分重要。糖链的获取通常需要使用糖酰胺酶，如为了研究自然界中较常见的N-糖链，目前多用N-糖酰胺酶进行酶解。当前研究较为充分的PNGase A和PNGase F两种酶均有优势，但也存在明显的缺陷，PNGase A只能作用糖肽、有自身去糖基化风险、不能在原核生物系统中表达[3]；PNGase F则不能作用于含α-1,3-核心岩藻糖结构的糖蛋白[4,5]。二者均不能完全满足糖组学飞速发展的需要，因此对N-糖酰胺酶进行进一步开发和研究具有重要意义。 新型N-糖酰胺酶PNGase Stca的克隆表达与特性研究(2):http://www.youerw.com/shiping/lunwen_20012.html