2。1。2 食用甲鱼蛋

甲鱼受精的蛋购自中国浙江杭州某甲鱼孵化场。用冷光灯照射检查每只甲鱼蛋，将某些发霉的或者没有胚胎的甲鱼蛋首先进行排除。每只甲鱼蛋用电子天平称量记录重量，精度到±1 mg。这些甲鱼蛋经大小测量并用铅笔做完标记后，被随机放入铺有潮湿蛭石的塑料孵化盒中并封口，每盒32只蛋，每只蛋独立孵化。实验人员将这些孵化盒放入设置了指定温度（28℃）的孵化箱中。孵化盒在孵化箱中会通过调整上下不同位置进行周期性的位置变换以减小孵化箱中的温度梯段对甲鱼蛋孵化的影响。每周定期两次检查这些甲鱼蛋，并在孵化盒中加入适量的水以保持蛭石的潮湿，给甲鱼蛋提供一个适宜的生长孵化环境。

2。1。3 主要分子生物学试剂

本实验使用Omega Bio-Tek (GA)的各试剂盒进行质粒抽提、基因组DNA的提取、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段和PCR产物的纯化，操作方法依照说明书进行。其中PCR扩增反应在Biometra Tpersonal PCR仪中进行。TA克隆载体使用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1 simple。另自中国Fermentas公司购得的限制性内切酶、碱性磷酸酯酶、T4多核苷酸激酶和T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司，并按照其产品说明书使用。

2。1。4 主要化学试剂

在研究中的所有化学试剂均从上海生工购买。

2。2 试验与方法文献综述

2。2。1 pEASYsUps45的构建

2。2。1。1 Ups45信号肽序列的克隆

使用下列引物扩增获得Ups45的信号肽序列：

引物名称 引物序列(5’-3’)a

sUps F3 GGAGCTCGCATG来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*GATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCT（下划线所标为SacⅠ酶切位点）

sUps R3 TCTAGAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACATTAA（下划线所标为XbaⅠ酶切位点）

PCR扩增反应体系如下：

sUps F3          0。5 μL

sUps R3          0。5 μL       

dNTP            4 μL

10×Taq buffer    2。5 μL

Taq              0。2 μL

ddH2O           17。3 μL

注：该PCR体系较为特殊，没有模板。因为引物的量比较大，其自身可提供模板。

反应温度设置如下：

94 ° C 5 min

94 ° C 30s

54 ° C 30s    25 cycles 

72 ° C 30s

72 ° C 10min

2。2。1。2 PCR产物回收纯化---胶回收

在紫外灯下割胶回收PCR产物，胶回收步骤参照OMEGA胶回收试剂盒使用说明进行，具体操作步骤如下：

1。在Washing Buffer里加100 mL的无水乙醇，并混合均匀待用；来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

2。向装有凝胶的离心管中加500 μLBinding Buffer，置55℃水浴锅中7min融胶；

3。将以上溶液转至柱子中，室温放置2min；

4。静置后10000rpm离心1分钟；

5。再重复步骤3、4，弃收集管中的废液；

6。往上述管中加300 μL Binding Buffer，10000rpm，1min，弃废液；

7。往上述管中加700 μL Washing Buffer，10000rpm，1min，弃废液；

食用甲鱼抗噬水气单胞菌口服疫苗载体的构建(3):http://www.youerw.com/shiping/lunwen_86129.html