解淀粉芽孢杆菌SQR9根际互作微生物的初步鉴定(2)
植物根际（根周围大约2mm的区域）组成了一个特殊的土壤生态位，由于根系分泌物的存在，许多土壤微生物被吸引到根际，竞争性定殖于这块土壤绿洲[6]。PGPR在植物根际的有效定殖（形成生物膜）是其发挥促生与生防功能的首要前提[7-8]。PGPR与植物互惠共生，一方面，PGPR能够为植物根系提供养分并促进根系吸收养分，抵御土传病原菌对植物的侵染，降解正在进入根际和根系的污染物[8]。另一方面，PGPR利用植物根系分泌物作为营养进行大量生长繁殖，并通过自身的代谢对根际土壤和根系产生影响。PGPR只有在根际定殖到一定程度，才能发挥PGPR的群集效益和功能[9]。
尽管自然环境中多菌种的混合型生物膜占主导地位[10]，但在实验室条件下的生物膜研究都还以单菌为主，例如解淀粉芽孢杆菌SQR9自身的生物膜形成机理已有一定研究，但未研究菌株SQR9与根际其他微生物的相互作用，以及这种相互作用对生物膜形成和根际定殖能力的影响。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是PGPR菌的代表菌株，与解淀粉芽孢杆菌SQR9亲缘关系较近，Shank等人发现，枯草芽孢杆菌能够响应土壤中相近种属细菌分泌的物质，如噻唑肽，影响自身生物膜基质基因的表达[11-12]。Nandy等人发现，枯草芽孢杆菌与大肠杆菌（Escherichia coli）混合培养时，能产生抗菌物质，裂解大肠杆菌细胞，掠夺营养用于自身生长[13]。芽孢杆菌单独接种木豆时，不能使木豆结瘤，也不能促进生长，而共同接种芽孢杆菌与根瘤菌（Rhizobium）则可以提高木豆的结瘤效率，芽孢杆菌还可以在缺铁条件下产生铁载体，供根瘤菌使用，促进根瘤菌生长[14]。本论文尝试在黄瓜根际筛选出与菌株SQR9互作的微生物，并研究其互作机理，为以后的研究提供材料和理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
供试菌株：解淀粉芽孢杆菌SQR9。
供试作物：黄瓜，品种为津春4号。
供试营养液：1/4 MS营养液：称取1.18 g MS培养基粉末，加双蒸水定容至1 L，用于植物培养。
供试土壤：大兴安岭黑土。
供试培养基：
MSgg培养基：磷酸钾缓冲液5 mM pH 7.0（磷酸氢二钾0.44 g*l-1，十二水合磷酸二氢钾0.42 g*l-1，丙三醇3 g*l-1，谷氨酸5 g*l-1），MOPS溶液100 mM pH 7.0，氯化镁2 mM，氯化钙700 μM，氯化铁50 μM，氯化锰50 μM，氯化锌1 μM，硫胺 2 μM，甘油0.5 %，谷氨酸0.5 %，色氨酸50 mg*ml-1，苯丙氨酸50 mg*ml-1，用于菌体生物膜的培养[15]。
1．2 方法
1．2．1 黄瓜根际土的分离[16]
选取大小一致、颗粒饱满的黄瓜种子，先用无菌水浸泡6 h，然后用2 %次氯酸钠溶液表面消毒2 min，再用75 %乙醇冲洗三次、无菌水冲洗三次，放置在培养皿上，30 ℃静置催芽48 h。胚根露出后，转移至含1/4 MS营养液的50 ml锥形瓶中无菌培养。长至两片真叶期时，挑选萌发较为一致的黄瓜苗移栽至装有2 kg黑土的花盆中（土壤研磨，过10目筛后使用），继续培育。黄瓜土培至四片真叶时期（开花期），将花盆倒置，穿戴已用酒精消毒的手套，小心剥离土壤，用小无菌铲轻拍，使土壤掉落；根表面剩余紧紧附着2 mm左右土壤（视为根际土），用已灭菌的剪刀将根剪下置于灭菌纸巾上；将携带有根际土的根放入30ml PBS-S缓冲液（6.33 g NaH2PO4•H2O，22 g Na2HPO4•12H2O，200 μl Silwet L-77，双蒸水1升）中；将50 ml离心管盖封好，管口用报纸包上，在摇床中180 rpm，20 min（室温）震荡；过100 μm尼龙细胞过滤器，去除植物根和大块沉积物；滤液置于50 ml灭菌离心管内，在室温下，3200 g下离心15 min，4 ℃暂时保存。
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