卤化天然产物生物合成基因的克隆(2)
卤素原子的加入能增强很多抗生素的生物活性,但通过化学合成来制备这类化合物非常昂贵,而通过直接操纵卤化酶基因为产生新的抗生素化合物提供了可能。例如Sánchez等[7]在白色链霉菌表达rebeccamycin和staurosporine的生物合成基因簇获得了新的杂合抗生素,并把来源于pyrrindomycin和thiendolin生物合成途径中的卤化酶分别引入该工程菌株,获得了在不同位置氯代的两种新型吲哚咔唑类化合物。虽然该合成过程只限于以色氨酸为底物,但该研究首次证明了通过遗传操作获得新卤化物的可行性。许多天然产物中的卤素取代基深刻影响着其生物活性，例如万古霉素，氯霉素，金霉素，瑞拜克霉素[8]。
微生物来源卤化天然产物具有良好的生物活性、较低的毒性等特点，在成药潜力方面具有化学合成药不可比拟的优点潜力，越来越多的研究者将目光转向了微生物来源卤化天然产物。随着研究的进展，从陆地生态环境发现新抗生素可能性越来越小，研究者将目光转向海洋、温泉及沙漠等特殊生境[9]。大多数含溴的卤化物来自海洋生物，海洋微生物富产生物碱[10]，陆地微生物主要合成含氯卤化物。有些海洋生物代谢物同时含有溴和氯[11]。海洋环境中蕴藏着最丰富的溴代卤化物[12]，这些次级代谢产物主要来源于海洋的藻类以及海洋的无脊椎动物[13]氯化代谢物主要由陆地生物产生，也有许多的氯化物来源于真菌代谢产物，碘化物相对较少，一般来源于海洋藻类，氟化物比较稀少。
本次研究中，卤化酶的筛选采用序列筛选的方法，选用Hornung A等人[14]从已知天然产物的卤化酶氨基酸保守序列出发设计的简并引物，采用简并引物筛选出卤化酶相关的基因，根据基因序列进一步设计特异引物筛选出克隆产生卤化物的潜力。测序得到的序列结果再与已知功能序列经过blastx进行比对，从比对的结果中，我们可以得到筛得的单克隆部分序列与已知化合物部分序列的相似度以及已知化合物的菌株来源，根据测序得到的序列与已知化合物的序列在MEGA上建立Neighbour Joining进化树，从进化树上可以直观的看到筛选得到的单克隆与已知化合物的远近。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
（1） 2×Taq Mix (上海捷瑞生物有限公司)
（2） Lamda-Hind III 标准分子量 （上海捷瑞生物有限公司）
（3）溴化乙靛（EB）工作浓度为0.5 µg/ml（上海捷瑞生物有限公司）
（4）简并引物：
上游引物：H-Cao-F2
下游引物：H-Cao-R
（5）质粒小提试剂盒（TIANGEN）
（6）琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN）
（7）二甲亚砜（DMSO）（上海生工生物有限公司）
（8）甘油（上海生工生物有限公司）
（9）氯化钠（上海生工生物有限公司）
（10）蛋白胨（上海生工生物有限公司）
（11）酵母粉（上海生工生物有限公司）
（12）琼脂粉（Solarbio公司）
（13）琼脂糖（genehk公司）
（14）无菌二次水
（15）100 μg/ml氨苄青霉素（上海捷瑞生物有限公司）
（16）15 µg/ml氯霉素（上海捷瑞生物有限公司）
（17）氨苄LB平板
（18）LB培养基（1L） 氯化钠NaCl 1%
酵母粉0.5%
蛋白胨1%
1%~2%琼脂 固体培养基