解淀粉芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其酶学性质研究(2)
天冬酰胺是生成丙烯酰胺必要的前体物质，L-天冬酰胺酶（EC3.5.1.1，L-asparaginase）[2]可水解L-天冬酰胺生成氨和L-天冬氨酸，如在食品加工前加入L-天冬酰胺酶可有效控制加工食品中的丙烯酰胺含量，且不影响产品的生产工艺、光感性状和觉性状等[3]。Richi V.M等[4]在薯条加工中加入L-天冬酰胺酶，使薯条中丙烯酰胺含量仅有原先的20%。Anese等[5]研究了饼干加工中L-天冬酰胺酶对丙烯酰胺的作用及对饼干外观的影响，发现添加L-天冬酰胺酶后饼干的丙烯酰胺含量明显下降且外观无改变。因此，L-天冬酰胺酶在食品工业中具有良好的发展和应用前景。
L-天冬酰胺酶广泛存在于生物界，但目前生产L-天冬酰胺酶的最重要方法是微生物发酵法，如欧文氏菌、地衣芽孢杆菌等[6-7]；生产食品级L-天冬酰胺酶的主要菌种为米黑根毛霉、米曲霉等[8-9]。存在的主要问题是野生菌菌株酶活不高，且产生的酶不能分泌至胞外，分离纯化较困难，使得回收率较低。采用基因工程的方法使L-天冬酰胺酶外源基因在代谢途径明确的菌种中高效表达，有望解决上述问题。1967年，Campbell发现EC-1和EC-2两种构型的L-天冬酰胺酶存在于E.coli中，其中具有抗癌作用的为EC-2[10] 。1969年，Peterson[11]用E. aroideae NRRLB-138发酵产L-天冬酰胺酶，分离纯化后酶活达275 IU•mL-1 该酶的最适PH为7.5.Santos等[12]以酿酒酵母为L-天冬酰胺酶基因来源导入至大肠杆菌中表达，并用亲和色谱法提取纯化目的蛋白，重组酶比活力达110.1±0.3 IU/mg，回收率40.5%。国内研究，陈浩然等[13]以大肠杆菌菌株（E. coli AS 1.357）为L-天冬酰胺酶基因来源，转化至大肠杆菌BL21中进行表达，重组酶活达137IU/ml ，比原始菌株提高20倍。梁毅偈等[14]从大肠杆菌Nissle 1917中提取L-天冬酰胺酶基因转化至大肠杆菌BL21中，目的基因得到高效表达并具有一定的抗肿瘤活性。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[15]是一种产芽孢的好氧格兰氏阳性杆菌，可产生丰富的次生代谢产物，有广谱抗菌活性，广泛应用于蔬果保鲜、环境治理等方面。国内外尚无以解淀粉芽孢杆菌为L-天冬酰胺酶基因来源进行克隆表达的研究报道，因此具有一定的研究价值。本研究利用基因工程的手段将L-天冬酰胺酶外源基因导入到大肠杆菌中以实现目的基因高效表达获得大量目的蛋白，为解淀粉芽孢杆菌作为L-天冬酰胺酶基因来源构建工程菌的研究在食品科学上的应用提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂、培养基
Omega公司细菌基因组提取试剂盒；琼脂糖（上海生工生物工程公司）、DNA marker，PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、E×Taq DNA聚合酶；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、咪唑、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、L-天冬酰胺；其他常用试剂均为国产分析纯，0.05 mol•L-1Tris-HCl缓冲液，0.05 mol•L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0-6.0)，0.05 mol•L-1 PBS缓冲液(pH7.1-8.9)，0.05 mol•L-1硼砂-氢氧化钠缓冲液(pH9.3-10.0)，奈氏试剂，LB培养基。
2.1.2 菌株与质粒
菌株：解淀粉芽孢杆菌、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞（酶工程实验室保藏）
质粒：重组克隆载体pMD19-T-BaAsnase，重组表达载体pET30a-BaAsnase为本研究中构建。
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