ABA、GAs和温度协同作用对芹菜种子萌发的影响(3)
1．2．3 外源GAs、ABA单因素处理
配置浓度为0.10、0.25、0.50、1.00、2.00g/L的GAs溶液和浓度为0.025、0.05、0.10、0.25、0.50g/L的ABA溶液，用每个溶液浸泡经过预处理后两个品种的芹菜种子24h，蒸馏水冲洗三次后转入底部铺有两层吸水纸的一次性培养皿中，于15℃恒温培养箱中培养，设三次重复，探讨不同浓度的外源GAs和ABA溶液的分别作用对不同品种的芹菜种子休眠和萌发的影响。
1．2．4 外源GAs和ABA协同处理
配置三种浓度（0.01、0.05、0.10g/L）的GAs与ABA溶液，以体积比分别为1:2、1:1和2:1的比例混合为9种溶液，分别浸泡经过预处理后的两个品种的芹菜种子24h，蒸馏水冲洗三次后转入底部铺有两层吸水纸的一次性培养皿中，于15℃恒温培养箱中培养，设三次重复，探讨不同浓度的外源GAs和ABA溶液协同作用对不同品种的芹菜种子休眠和萌发的影响。
1．2．5 RNA的提取及cDNA的合成
采用Tiangen 公司的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒，按步骤从‘津南实芹’的对照组（CK2）及经浓度为1.00g/L和2.00g/L的GAs溶液处理的25天苗中提取总RNA。之后用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将提取出来的三份总RNA反转录成cDNA，为了避免RNA中可能混有的DNA对实验结果造成干扰，需提前进行DNA消化实验。
1．2．6 芹菜苗中α-淀粉酶基因的克隆
根据GenBank中拟南芥AtAMY设计出1对引物（AgAMYF1和AgAMYR1）。在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列，在Tm窗口中，输入候选的上游引物序列位置。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。
以cDNA第1链为模板进行扩增，PCR 反应条件设定为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 s，共30个循环；72℃ 10 min。之后将获得的PCR产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察拍照后，进行大片段胶回收。连接pMD18-T载体后，转化大肠杆菌DH5α，挑菌并进行菌液PCR鉴定之后开始摇菌，提取质粒，将得到的质粒送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
1．2．7 序列分析
拟南芥、大麦等AMY基因的核苷酸序列来自于NCBI数据库。使用BLAST进行序列比对，蛋白质预测分析使用ffPred（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/），进化树分析使用MEGA 6。
1．2．8 实时定量PCR反应
采用ABI 7500 RealTime PCR System和7500 System software version 1.2.3进行实时定量PCR（Relative quantitative real-time RT-PCR）分析。将芹菜的actin基因作为参考，与目标基因一起进行扩增。根据基因序列设计引物，见表1。使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq 试剂盒进行实时定量PCR，按照试剂盒内操作步骤进行试验。相对定量使用比较CT法，诱导率等于2−ΔΔCT，ΔΔCT=(CT目标基因－CT actin)处理－(CT目标基因－CT actin)对照。