番茄免疫受体蛋白Sw-5b与番茄斑萎病毒移动蛋白NSm互作分子机制研究(3)
生物的遗传信息是由核苷酸序列存储的，但是生命活动的特征表现则是由蛋白质来表现出来的。研究生物的特征与一系列的生理生化活动就是研究蛋白质的相互作用，特别是在研究抗性基因对病原物的抗性作用时，了解他们的作用形式，以及一系列的作用机理，都有着重要的作用。在众多的研究方法中，本实验主要采用了免疫共沉淀、荧光栓分子分析、GST pull-down 三种方法来验证NSm与NTD1的相互作用
细胞在不经过剧烈的物理或化学作用的破坏后，细胞内原本已经结合的蛋白质也会被完整的保存下来，在经过适当的实验操作后，就可以得到纯净的结合蛋白。存在有相关基因的大肠杆菌内产生了NTD1与NSm的蛋白复合物，如果用NTD1的抗体免疫沉淀NTD1，可以发现与NTD1在体内结合的蛋白质NSm也会被沉淀下来。用NTD1的抗体进行WB检测NSm蛋白，假如NTD1与NSm均出现，则说明NTD1-NSm复合物的存在，即可证明蛋白的互作。
双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）是依据荧光蛋白发展出来在体内研究蛋白相互作用的一种新兴技术。黄色荧光蛋白YFP（Yellow fluorescent protein）与其突变体都是通过在细胞体内表达出完整的氨基酸序列，并作为检测标准的一种报告基因。起先将YFP荧光基因融合目的蛋白可分为3种方式，N端融合、C端融合和将荧光蛋白基因与目的基因整个连接，其中YFP蛋白都是完整表达出来的的，都可以正常显示出荧光被检测到。在经过进一步的对该序列进行分析发现，Baird[11]等在对这个循环序列分析找出10个位点，这些位点可以被切开，在细胞内可以进行正常的表达，不会显示出正常的荧光活性，但这些被切开的无活性的蛋白相互接触后则会正常表现出荧光活性，从而可以作为标识而被检测到。因此，将荧光基因切成两段后分别与NSm和NTD1相连接，形成融合基因YNE-NSm、YCE-NSm、YNE-NTD1、YCE-NTD1。当两段基因在细胞内共同表达之后，就会是两段荧光蛋白相互靠近，形成完整的荧光蛋白，显示出荧光，证明其互作。
GST-pull down技术能够利用体外验证，通过原核表达出的NSm与NTD1两种蛋白之间是否可能会存在直接的相互作用。谷胱甘肽疏基转移酶（GST）可以作为一种标签，可以将其与NTD1和NSm共表达，形成融合蛋白，它可以与谷胱甘肽发生特异性结合，另一种是组氨酸（His）标签进行的。GST在使用过程中也有助于重组的融合蛋白NTD1与NSm的正常表达，使实验顺利进行[15]。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 植物材料
在恒温培养房中培养一个月大的本氏烟植株。
1.1.2 菌株和质粒
大肠杆菌DH5ɑ和农杆菌GV3101是由实验室自制并保存在-80℃冰箱中。实验载体pMD 18-T是从 TaKaRa公司购买。其他所需载体p2300-35S、pGEX-4T-3质粒、pET28质粒，pSPYNE 和pSPYCE BiFC载体均为本实验室所有。
1.1.3 主要试剂
DNA连接酶购自大连公司，T4 DNA连接酶和其他所需的各种限制性内切酶购自Promega公司；Flag和Anti单克隆抗体与protein G plus-agarose immunoprecipitation reagent购自Santa Cruz公司；羊抗鼠IgG由Sigma公司所购买。 PCR所用扩增酶、Prime STAR，均购于TaKaRa公司。
1．2 方法
1.2.1 目的基因的扩增和克隆
分别以重组子Flag-NTD1，Flag-NTD2，Flag-CC, Flag-CC-NB-LRR ，Flag-GST-GEF-PD ，Flag-NTD-CC，Flag-NB-LRRP-Loop Mutant为模板，PCR扩增目的基因，凝胶电泳观察片段大小，验证片段是否正确，将目的基因双酶切后直接回收单独的NTD1与NSm目的片段的获得与上述方法相似。
1.2.2 载体的构建
使用EcoR I和BamH I分别双酶切回收产物，直接回收，并与p2300-35S载体在4℃下连接过夜。连接产物吸收5μL转入大肠杆菌DH5ɑ，选取Kana的LB固体培养基涂布平板，37℃放置恒温培养箱生长过夜。挑选长出的菌落，进行菌落PCR鉴定，用载体上游引物与片段下游引物筛选，筛选获得含有目的基因阳性克隆。并将其分别命名为p2300-NTD1，p2300-NTD2，p2300-CC，p2300-CC-NB-LRR ，p2300-GST-GEF-PD ，p2300-NTD-CC，p2300-NB-LRRP-Loop Mutant。
上一篇：两种茧蜂对其寄主黏虫的非致死效应