南京地区犬多耐药基因（MDR1）碱基缺失的PCR检测(2)
目前国内仅有于艳英等对3例苏格兰牧羊犬MDR1基因的突变进行了检测，发现有4bp碱基的缺失，然而对我国多种犬MDR1基因突变情况及发生频率的研究尚未有报道，我们尚不清楚该地区哪些品种的犬存在MDR1基因的碱基缺失，若能对多种犬类做MDR1基因的检测并统计结果，或在用药前或体检时对犬进行MDR1基因的检测，会对兽医工作者和畜主来说在临床用药时具有重要的指导意义。另外对于犬的繁殖来说有利于优化育种，检测并及时淘汰MDR1基因杂合突变和纯合突变犬，防止后代携带突变基因。因此我们对南京地区犬MDR1基因的突变情况进行检测，以期为临床用药和优化育种提供指导。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 样品采集
试验的所有样品均来自南京农业大学动物医院有限责任公司的病例或打疫苗的健康犬，共229份样品，其中包括212份血样和17份口腔拭子。血样样品中有204份用EDTA抗凝，8份用肝素锂抗凝，口腔拭子用棉签在犬口腔内适当刮取唾液和掉落的细胞后连棉签一起置于含有1-2 mL生理盐水的EP管中。采样后将样品置于-20 ℃冰箱冷藏保存。229份样品按照采样时间先后编号为：A1-A23，B1-B24，C1-C24，D1-D24，E1-E24，F1-F24，G1-G23，H1-H14，I1-I18，J1-J24，K1-K24，L1-L20。
1.1.2 主要试剂
细胞裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mol/L EDTA（pH 8.0），0.5% （m/V）SDS（pH 7.2））、5×TBE电泳缓冲液（54 g/L Tris，27.5 g/L硼酸，20 mL 0.5 mol/LEDTA（pH 8.0））、50×TAE电泳缓冲液（242 g/L Tris，57.1 mL/L冰醋酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0））、银染固定液（100 mL/L无水乙醇，5 mL/L冰醋酸）、银染染色液（100 mL/L无水乙醇，5 mL/L冰醋酸，2 g/L硝酸银）、银染显色液（30 g/L NaOH，5 mL/L甲醛）。
0.1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）平衡过的苯酚、TEMED、丙烯酰胺、N，N’-亚甲双丙烯酰胺购自北京索莱宝科技有限公司、琼脂糖购自南京生兴生物科技有限公司、GoldView I型核酸染色剂购自Solarbio。蛋白酶K（10 mg/mL）、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O、DNA Marker I等购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
低温冷冻离心机（型号：5417R），购自德国eppendoff； PCR仪（型号：Veriti™ 96），购自美国 Applied Biosystems；双垂直电泳槽（型号：A130649），购自北京市优尔一仪器厂；凝胶成像系统（型号：GIS-2500），购自美国 Bio-Rad公司；脱色摇床（型号：TY-80S），购自南京大学普阳科学仪器研究所。
1.1.4 引物的设计与合成
PCR引物的设计根据犬MDR1 cDNA序列（Accession number AF045016），参考Mealey的报道[2]，设计引物扩增148 bp野生型片段和144 bp突变型片段。引物序列如下：上游引物(MDR1 200-225 bp)：5'-GGCTTGATAGGTTGTATATGTTGGTG-3'；下游引物(MDR1 347-323 bp)：5'-ATTATAACTGGAAAAGTTTTGTTT-3'。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 犬基因组DNA提取
本实验采取用蛋白酶K消化和苯酚抽提从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA的方法提取犬基因组DNA。其操作步骤为:
a. 取100 µL的全血或口腔拭子样品与400 µL细胞裂解缓冲液于1.5 mL EP管混合，并于37 ℃温育1 h。
b. 体系中加入20 mg/mL蛋白酶K 2.5 µL或10 mg/mL蛋白酶K 5 µL至终浓度100 ug/mL，混合后置于50℃水浴锅中消化1-3 h。
c. 将溶液冷却至室温，加入等体积的用0.1 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）平衡过的苯酚，剧烈震荡混合两相，使其形成乳浊液。
d. 将EP管置于低温冷冻离心机上，室温以12000 r/min转速离心10 min以分离两相。
e. 用移液枪小心吸取450 µL上层水相至一新的EP管，注意不要吸白色的中间层。加入0.2倍体积，即90 µL的10 mol/L醋酸铵，和2-2.5倍体积，即约1 mL无水乙醇，混合后以室温12000 r/min转速离心5 min使DNA沉淀。
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