进境苹果重要病原真菌高通量测序排查及检测技术研究(3)
1. 3 PCR扩增、测序
50μL的PCR反应体系，其中包括10μmol/L上下游引物各1ul、0.25μL Taq DNA聚合酶（Qiagen）、5μL 10xBuffer、1μL 10mmol/L dNTP、3.5μL Mgcl2以及100-200ng DNA模板，最后加入ddH2O补足50μL。反应条件为95℃预变性5min，35个循环反应：95℃变性30s，最佳退火温度（ITS 55℃、SSU 52℃、LSU 42℃、EF-1α 51℃）30s，72℃延伸（1000bp/min），最后72℃延伸10min。PCR产物用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒（Qiagen）纯化产物，送于life technologies 测序公司ABI序列分析仪进行序列测定。为保证测序的准确性，采用双向测序，测序引物为 PCR 扩增引物。引物ITS-F的序列：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，引物ITS-R的序列：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。
1. 4序列差异分析
用SeqMan7.1.0软件进行正反向序列的拼接以及BioEdit 7.1.3软件校正序列。所有序列比对采用两种方法：MegAlign7.1.0软件中Cluster W全局比对和BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）局部比对；BLAST软件采用默认的DNA分值系统。所有生物信息数据用于评估各基因的碱基多样性和差异。
1. 5 ITS高通量数据库构建
将所有可检测的物种（序列差异度> 0.2%）的ITS测序结果按种名及所属的分类阶元归类，然后用Bowtie2以及BLAST软件分别构建高通量ITS核酸数据库，所有软件按默认参数建库。
2 结果与分析
2．1 ITS基因PCR及测序结果
ITS测序和PCR扩增情况统计见下表：红色：测序杂乱；蓝色：PCR条带较暗或无；绿色:测序无结果；橙色：测序无信号；白色：正常。