Microbulbifer sp. A4B-17菌株的分支酸裂解酶基因研究(2)
现在的4HBA生产工艺一般为化学合成，以石油产物的苯和丙烯出发【6】，造成温室效应增加，工业排水困难。此工艺需要消耗大量能源因而导致生产效率低成本高【7】。特别是合成过程中还有环境污染物的产生【8】，这会给环境带来不好的影响，当今环境问题已经非常严重，为实行可持续性发展，开发利用可再生资源取代石化资源是当务之急，。利用微生物的芳香族氨基酸合成途径，这条途径可以合成4HBA。莽草酸途径通常存在于植物、真菌和微生物中的一条重要代谢途径【9】，这样就可以通过生物方法合成4HBA，即利用可再生资源的糖类取代石化资源合成4HBA及其酯类可有效缓解环境污染和资源枯竭等社会问题【10】。
分支酸裂解酶：在A4B-17菌株的基因组中没有发现4-HCHL基因，表明在A4B-17菌株中没有合成4HBA的HCHL途径【11】。分支酸裂解酶是一种可以将分支酸转化为4HBA和丙酮酸酯的酶。在大肠杆菌和其他的革兰氏阴性细菌中，该酶催化合成泛醌的第一步反应。在A4B-17菌株基因组中只发现一个分支酸裂解酶（GL000722），它与E. coli UbiC有33.0%的同源性。4-Hdroxybenzoate octaprenyltransferase gene (ubiA, GL000721)位于GL000722的上游且相同方向，它负责生物合成泛醌途径上4HBA下一步的反应【12】。UbiC不仅仅是泛醌而且也是4HBA衍生物合成的关键酶。
1 材料与方法
1.1菌株和质粒
Microbulbifer sp.A4B-17 菌株；大肠杆菌JM109菌
质粒：pColdⅣ
1.2普通试剂
蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂条、X-Gal、IPTG、二甲基甲酰胺、去离子、冰醋酸、溴化乙锭、Tris 、Na2EDTA•2H2O、Glucose、EDTA、SDS、NaOH、4HBA钠盐、甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇。这些试剂产自上海生工生物科技有限公司。
1.3分子生物学相关试剂
（1）XhoⅠ：宝生物工程有限公司，酶切PCR产物和载体
（2）NdeⅠ：宝生物工程有限公司，酶切PCR产物和载体
（3）PrimeSTAR(2×)：宝生物工程有限公司，是PCR反应中的dNTP Mixture、DNA聚合酶、Buffer的2倍浓度混合物，在PCR反应体系中只需加入引物和模板，简化操作程序，减少整个过程的污染，校正功能强，其产物一般都是平末端。
（4）Markers（DNA ladder）：上海生工生物科技有限公司
（5）RNase：上海生工生物科技有限公司
1.4培养基及其配制
（1）LB培养基
NaCl 10 g/L、酵母提取物 5 g/L和蛋白胨 10 g/L。按此比例制备培养基，用蒸馏水进行定容，最后在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，冷却备用。
（2）LB固体培养基（+100 rAmp）
按培养基的制备过程，在培养基冷却至50~60 ℃时，进入无菌室的超净工作台进行操作，在培养基中加入Amp，使终浓度为100 mg/ml。然后把培养基放在磁力搅拌器上搅拌，使之混合均匀，最后进行倒平板，做好标记。
1.5筛选使用的试剂
（1）X-Gal（40 mg/ml，25 ml）：电子天平称量0.5 g的X-Gal固体放在大离心管中，再加入12.5 ml的二甲基甲酰胺，之后用枪头混合均匀，最后用1.5 mL离心管小份分装，在-20 ℃的条件下保存。
（2）IPTG(24 mg/ml，25 ml)：电子天平称量0.6 g的IPTG固体放在大离心管中，用灭菌水使之溶解，定容至25 mL，然后在超净工作台用滤液器过滤除菌，最后小份分装于1.5 mL离心管中，在-20 ℃避光的条件下保存。
1.6提取DNA时的溶液
（1）SolutionⅠ(200 mL)：取181 mL的去离子水放入试剂瓶中，100 ℃蒸汽灭菌后加入10 mL1M的Glucose和4 mL0.5M的EDTA(PH8.0)以及5 mL1M的Tris-HCl(PH8.0)缓冲液。该溶液在提取DNA中作为一种缓冲液。
（2）SolutionⅡ(200 mL)：现配现用，176 mL的去离子水在高压灭菌后，向其中缓慢加入20 mL10％的SDS和4 mL10 N的NaOH，在37 ℃水浴条件下直到溶液澄清即可使用。该溶液在DNA提取中用于破碎细胞。