一株红球菌属植物内生放线菌的分类研究(2)
1.2 实验仪器
1.3 实验方法1.3.1表型特征研究参照国际上面的有关放线菌培养的特征观察常用培养基 [9]，选用 ISP 2，ISP 3，ISP 4，ISP 5, 以及 PDA、营养琼脂等共多种固体培养基。在 28 ℃接菌到固体平板上，于两周之后观察菌的生长情况，颜色记录就参照 ISCC COLORCHARTS标准色谱卡[10]。
1.3.2 生理生化特征
1.3.2.1 NaCl耐受实验在 ISP 2 固体培养基之中，分别加进NaCl，浓度达到 0%-15%（间隔1%），28 ℃培养， 14 天之后观察菌生长的情况。1.3.2.2 pH耐受实验以 ISP 2 作为基础培养，测定pH 的耐受范围（pH 5.0-9.0），在基础的培养基中加 pH缓冲液，28 ℃培养，14 天后观察菌生长的情况，并且重复3次。1.3.2.3 温度耐受试验将菌接入到 ISP 2固体平板，分别在 4、10、15、28 、37 、45 和50℃条件下培养，14 天后观察菌生长的情况。1.3.2.4 利用碳源生长试验碳源利用基础培养基：(NH4)2SO4 2.64 g；KH2PO4 2.38 g；K2HPO4 5.65 g；MgSO4 •7H2O 1.0 g； CuSO4 •5H2O 0.0064 g； FeSO4 •7H2O 0.0011 g ；MnCl2 •4H2O 0.0079 g；ZnSO4•7H2O 0.0015 g；双蒸水 1000 mL；pH 7.0。按照不同碳源的浓度加进基础培养基。1.3.2.5利用不同氮源生长试验氮源利用基础培养基：NaCl 0.05g，FeSO4 •7H2O 0.001 g，MgSO4 •7H2O0.05 g，K2HPO4 0.01 g，葡萄糖 1 g。按 0.5%浓度在基础培养基之中加入不同氮源。培养 14天之后，和不加氮源基础培养基的生长情况作为比较。
1.3.2.6其它生理生化试验氧化酶、接触酶、脲酶、酯酶、淀粉水解、明胶液化、牛奶凝固与胨化、纤文素水解、硝酸盐还原、色素产生、H2S产生等等测试按照《常见细菌系统鉴定手册》[11]及 Gordon[12]等人的方法来进行。1.3.3 化学分类研究1.3.3.1 细胞膜极性脂组成分析提取、纯化及组分分析磷酸类脂方法按照 Minnikin 等[14]、Collins 和Jones[15]的方法来进行。1.3.3.2甲基萘醌分析醌的提取和分析参照 Collins[16]方法，并且用HPLC 法[17]来进行分析。
1.3.3.3脂肪酸组分分析使用美国 MIDI公司的微生物脂肪酸鉴定系统， 并且利用气相色谱进行分析[18]。1.3.4 分子分类1.3.4.1 菌株总DNA 提取与16S rRNA 基因扩增菌株D-7 的基因组DNA 提取可以采用微波法提取,破坏其细胞壁， 促使核酸物质从细胞内释放，以便提高它的提取率[19]，将提取的基因组 DNA 作为模板在PCR 仪上基因扩增。所采用的引物为 PA: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，PB: 5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。 PCR 反应体系（50 μL）包括：DNA模板 2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl2 (25 mM) 3 μL，dNTPMixture (10 mM each) 1μL，Taq 酶 (5 U) 0.5 μL，引物各 1μL，无菌水不足到 50μL。PCR 反应程序是：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，54 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 3 min，最后再72 ℃延伸 10 min，4 ℃长期保持。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶在凝胶成像仪中检测有没有目的片段，大小为1500 bp 左右。1.3.4.2菌株 16S rRNA基因的系统发育分析PCR扩增产物序列测定工作由上海生工生物工程有限公司完成。根据测序的结果，用EzTaxon数据库进行序列比对，根据其相似性确定菌株属于哪一个属，并且选调出该属相似性比较高的典型发表种的16S rRNA基因序列，用Clustal X1.8软件进行多序列的比对，之后用Mega 5.1 软件进行系统发育树的构建，建树采用邻接法。
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