植物是固定生长的生物,无法选择生存环境,必须经受各种生物和非生物胁迫的压力。研究发现大量植物基因受到营养缺陷、干旱、高盐、极端温度等各种非生物胁迫的调控[1,2]。植物耐盐机制的最新研究成果可以总结为:通过降低植物盐胁迫的损伤程度,建立内部渗透平衡和钠离子内稳态,调控自身生长状态这三个方面。在盐胁迫下,植物常常表现出复杂的分子响应机制,包括大量积累胁迫相关渗透因子和调控蛋白,阻止细胞结构受损;或通过提高抗氧化酶及还原性物质加工酶的表达,清除植物体内的活性氧,从而减轻植株所受的盐离子毒害作用[3]。钠离子(Na+)是土壤中浓度最高的一种离子,能被大部分植物吸收,在高盐胁迫下,Na+毒害是植物细胞内最主要的离子毒害[4,5]。为使作物能正常生长,植物需要在胁迫条件下建立新的离子稳态,通过将Na+外排出细胞膜或者泵入液泡储存起来的方式来维持体内的离子平衡。

研究发现植物MicroRNA(miRNA)也参与了盐胁迫调控机制。miRNA是一类由20~24个核苷酸组成的内源RNA分子,不翻译产生功能蛋白,通过DNA甲基化修饰改变染色质结构、降解mRNA转录产物、以及抑制蛋白翻译三个方面调节细胞各种生理生化活动[6]。拟南芥miR393是少数几个被报道受到逆境胁迫诱导的miRNA之一,其靶基因TIR1/AFBs家族是生长素受体[9-11],处在生长素信号转导的关键位置,对植物逆境生长有着重要的研究意义。miR393是一段21个核苷酸组成的miRNA分子,在多种植物中保守[7]。研究发现miR393的表达量在高盐下(300mM NaCl)有1.55倍的上调[8]。水稻miR393在转录后水平负调控生长素受体基因OsTIR1和OsAFB2,影响生长素信号通路,miR393过表达植株分蘖多、开花早,盐敏感性增高;反之,OsTIR1或OsAFB2过表达植株对盐的耐受性更强[12]。但有关植物miR393及其靶基因如何在拟南芥中起作用,从而增强植株的盐胁迫耐受性仍有许多问题需要解答。

    本研究拟使用抗miR393作用的mTIR1基因过量表达转基因系、靶基因功能缺失突变体tir1-1等材料,以野生型拟南芥为参照,考察盐胁迫下各种株系的耐受能力。从渗透因子,抗氧化酶及离子平衡等角度入手,测定脯氨酸、SOD活性和丙二醛产生量变化等生理数据,综合分析过量表达mTIR1如何参与植物耐盐胁迫应答,发挥了怎样的潜在作用机制,为植物的耐盐机制研究提供新的数据和参考。

1 过表达mTIR1影响拟南芥的盐胁迫耐受性

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

用于盐胁迫耐受性实验的拟南芥包括:Columbia-0野生型,转基因纯合35S:mTIR1-7,35S:mTIR1-9,35S:MIR393a-1,35S:393MIRa-6,35S:MIR393b-1,35S:MIR393b-2株系,以及突变体tir1-1,quadruple拟南芥在光照培养室内培养,控制恒温22~24 ℃,湿度60%,16 h光照/8 h黑暗。

1.1.2 主要试剂和主要使用仪器

主要试剂:B5培养基(sigma),NaCl,丙酮,无水乙醇。

主要使用仪器:紫外分光光度计,恒温恒湿光照培养箱,超净工作台,纯水仪,pH计等仪器。

1.1.3 盐胁迫下种子萌发率统计

①将适当的拟南芥种子置于1.5ml的离心管中,1 ml 70%酒精混匀3 min,并小心吸除。

②1.5 ml 10% NaClO混匀10 min后吸除。

③无菌水1 ml洗种子4~5遍,每次清洗时要吹。

④第四次时加入1.5 ml无菌水静置8 min,吸出后再水洗1~2遍。

⑤剩少量水,用灭菌的1 ml移液器将表面消毒后的种子点在分别含NaCl(0 mM,100 mM,150 mM,200 mM)的新鲜培养基上进行培养。每个株系80颗种子,透气胶带封口后置于4 ℃的冰箱中春化2 d,破除种子休眠。

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