TOR对于灵芝生长及灵芝酸合成的影响(3)
（2）液体发酵培养：将WT、CK1、CK2、T-1、T-8、T-12灵芝液体发酵种子接种于装有100 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中，放入150 r/min，28 ℃摇床培养4~5天，将灵芝菌丝球培养至生长对数期。小型种子打碎机将摇瓶培养的液体种子匀浆打碎，将100 mL CYM培养液装入250 mL摇瓶，每瓶接种匀浆5 mL。放入150 r/min，28 ℃摇床培养11天（WT+RAPA处理每100 mL CYM液体加入10 μL 0.125mg/ mL RAPA抗生素）。
1.2.2 菌丝生长情况测定
选取野生型WT、对照CK1、CK2、沉默株T-1、T-8、T-12六种长势较好菌株活化平板，并用Ф=6 mm的无菌打孔器进行打孔，将菌块接种至CYM平板上（雷帕霉素处理的野生型WT+RAPA接种的平板提前雷帕霉素处理），放入28 ℃温箱培养5天，取出观察菌丝生长形态，并记录菌落直径。
1.2.3 灵芝酸含量的测定
1） 用分析天平，精密称取烘干的样品（WT、CK1、CK2、T-1、T-8、T-12、WT+RAPA）0.2 g，用95% 乙醇浸泡样品，并定容至10 mL，超声破碎两小时，每20 min摇动一次，取1.5 mL 4000 r/min离心10 min，取400 μL上清液备用。
2）参比配置：准确吸取0.1 mL 95%乙醇于10 mL具塞试管，并进行3个重复。
3）精确提取0.10 mL上清加入10 mL具塞试管中，依次加入0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，混匀，盖盖，每种样品重复三次，60 ℃水浴20 min，取出后立即冷却10 min，然后加入冰醋酸5.00 mL，用试管振荡器混匀后于550 nm处测定吸光度。
1.2.4 菌丝分叉检测
在已经接种有菌块的平板培养基上斜插已经灭菌的盖玻片，放置于28℃恒温培养箱进行培养，等菌丝生长爬上盖玻片后将盖玻片取下，用2.5 μg/mL 的荧光增白剂进行染色后，利用荧光显微镜进行观察，并统计每个处理的菌丝分叉间距。
1.2.5 DCFH-DA染色法测定胞内ROS浓度
将生长在固体培养基上插片的菌丝培养4-7天取出盖玻片进行H2O2的荧光检测。采用DHCF-DA（2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐）荧光探针结合荧光显微镜（Zeiss Axio Imager. A1 Fluorescence Microscope）进行观察。将长有菌丝的盖玻片28℃孵育与10μmol DCHF-DA持续15分钟，用10mML磷酸钠缓冲液（pH=7.5）洗涤2-3次去除残余染液后置于激光共聚焦显微镜下观察。