发霉花生果荚上主要霉菌的分离与初步鉴定(2)
由于霉菌在这个大千世界的数量是可观的，与人们的生产生活也是密切相关。因此，大量资料显示，目前，学者们对霉菌各方面的研究颇多。尤其是在酒酿造过程中易染霉菌、酸奶中污染霉菌、烟叶霉腐微生物及发霉馒头或面包中曲霉等方面的研究较多[13-17]，但对关于发霉花生果荚上主要霉菌的研究还不多见。本实验从微生物学角度，以自然状态下发霉的花生作为实验材料，对发霉花生果荚上主要霉菌进行分离纯化与初步鉴定，研究花生果荚上霉菌的种类及优势菌群。该实验有利于进一步研究霉菌的各种生物学特性及其代谢产物对花生果发霉过程中的影响，对花生更好的储藏有重要意义。
1 实验材料
1.1 时间与地点
实验于2014年在周口师范学院生命科学与农学学院微生物学实验室内进行。
1.2 实验材料、试剂和用品
材料：自然状态下发霉的花生。
试剂：硝酸钠，磷酸氢二钾，氯化钾，硫酸亚铁，蔗糖，琼脂粉等。
用品：量筒，烧杯，试管，玻璃棒，三角瓶，培养皿，酒精灯，报纸，接种针，接种环，载玻片，盖玻片等。
1.3 实验仪器
AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司
SW-CJ-2FD型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂
电热恒温培养箱 上海恒科学仪器有限公司
DL-1型万用电炉子 北京市永光明医疗仪器有限公司
BX41显微镜 广州市明美光电技术有限公司
2 实验方法
2.1 培养基的配制
参考相关资料[18]，分别配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和查氏培养基（CA），具体如下。
2.1.1 分离培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）营养丰富，用于霉菌的分离纯化。将称量好的400 g去皮的土豆块放入铝锅中，加蒸馏水在电炉上煮30 min左右，用8层纱布过滤，将滤液过滤到大烧杯中，先边加热边加入40 g琼脂粉，待琼脂完全溶化后再加入40 g葡萄糖搅拌，至葡萄糖完全溶化后停止加热，最后定容到2000 mL。此培养基采用自然酸碱度，无需调PH。然后分装于6个三角瓶中，置于121.6 ℃、0.056 MPa的高温高压下灭菌20 min，即可做接种或平板培养待用。
2.1.2 鉴别培养基
霉菌的鉴定用查氏培养基（CA）：用电子天平分别秤取硝酸钠4 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁(MgSO4•7H2O)1 g、氯化钾1 g、硫酸亚铁0.02 g、蔗糖60 g和琼脂粉40 g，然后分别用蒸馏水溶解后倒入铝锅中，再加入适量的蒸馏水，边加热边用玻璃棒搅拌，待沸腾后培养基呈透明状态时，停止加热，加蒸馏水定容至2000 mL，此培养基pH值为自然。然后分装于6个三角瓶中，置于121.6 ℃、0.056 MPa的高温高压下灭菌20 min，即可做接种或平板培养待用。
2.2 霉菌的分离纯化
在超净工作台内，用镊子将发霉的花生果荚放置于PDA固体培养基中，共接种三皿，放在28 ℃恒温培养箱中培养4~6 d。待长出菌落后，采用平板划线分离法，无菌条件下，挑取单菌落在PDA平皿上划线，于28 ℃培养4~6 d，待菌种纯化后用于形态观察接种。如果菌落菌体不纯，混有杂菌时，则重新划线分离，直至菌体纯化为止。
2.3 霉菌的鉴定培养
在超净工作台内，用接种针挑取上述已纯化的极少量孢子，点植于查氏培养
基平板上，接种时应尽量避免孢子散落于培养皿其他位置[19]，然后将培养皿置于28 ℃恒温箱中培养，经4~7 d后观察记录菌落特征并拍照。霉菌鉴定通常以其形态鉴定为主，通过观察菌落、菌体形态对霉菌进行综合鉴定，鉴定方法依据参考有关真菌鉴定资料[20-22]。