摘要CRISPR/Cas9 作为时下炙手可热的基因组编辑工具，具有强大的功能和良好的应用 前景，因为其设计简便、经济快捷等优点，它不仅广泛应用于原核生物细胞中，而且也越 来越多地应用于哺乳动物真核细胞和植物真核细胞中的基因编辑。如果我们课题组能够 建立起 CRISPR/Cas9 系统这一基因编辑工具，将极大地促进我们的研究工作。本毕业设 计欲在我们的课题组建立起 CRISPR/Cas9 实验系统，利用其构建基因敲除细胞。我们采 用 lentiCRISPR v2 质粒作为载体，设计了靶基因的 gRNA 序列，并在经过退火后将其连 接到 lentiCRISPR v2 载体中，最终构建 sgRNA-lentiCRISPR 质粒。在构建过程中我们遇 到了一些困难，在连接之后出现了同源重组的现象，经过分析我们拟采用 intron 或者 intein 修饰 spCas9，并使用更可靠的感受态细胞进行后续实验。73307

毕业论文关键词 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术 gRNA 设计 转化 sgRNA 载体构建

毕 业 设 计 说 明 书 外 文 摘 要

Title  Constructing Rip1 gene knock-out cells through  CRISPR/Cas9 system

Abstract As the most popular genome editing tool，CRISPR/Cas9 possesses both powerful functions and promising application prospects。 Due to its simplicity and low cost, CRISPR/Cas9 has been widely applied in both prokaryotic cells and eukaryotic cells。 Therefore, it will greatly advance our research if we establish the platform of CRISPR/Cas9 in our lab and make good use of it。 This graduation project aim to establish CRISPR/Cas9 system and construct gene knock- out cells using it。 We chose lentiCRISPR v2 as the carrier plasmid and designed the gRNA sequence of targeted gene Rip1, and linked them to construct sgRNA- lentiCRISPR after annealing。 However, we failed and encountered several troubles: homologous recombination took place after linking。 After analysis, we plan to modify spCas9 by intron or intein to overcome the obstacle in the future。 Meanwhile, we will employ another RecA competent cells which hopefully will inhibit the occurrence of homologous recombination and lead to the success of the plasmid construct。

Keywords CRISPR/Cas9 genome editing gRNA designing transforming constructing of sgRNA

本科毕业设计说明书 第 I 页

目 次

1 绪论 1

1。1 研究背景及其意义 1

1。2 锌指核酸酶，ZFNs 1

1。3 类转录激活因子效应物核酸酶，TALENs… 2

1。4 成簇规律间隔的短回文重复序列系统，CRISPR 3

1。5 本毕业设计的研究目的 9

1。6 论文组织结构 9

2 实验部分 10

2。1 实验材料与试剂 10 

2。2