1.5.2 脂质体转染
将质粒pUA2B2-BS10-VP2-gpt提取出来,然后进行纯化,按脂质体(Lipofectamine TM 2000)使用说明书的方法转染CEF,具体步骤如下:
(1)在我们开始进行转染的前一天,将生长比较好的原代成纤文细胞(CEF)的单层细胞用胰酶进行消化,然后在每个孔中加入0.5-2 x 105细胞和500ul无抗生素的培养基。等到生长到一定程度时,一般为生长到90%-95%满的时候,在细胞单层上按0.1 TCID50的MOI(multiplicity of infection,感染复数)量接种HVT
细胞培养液,37℃吸附1 h。
(2)DNA-脂质体混合物的制备:
a.我们将使用50 ul没有血清也没有抗生素的DMEM培养基稀释1 ug转移质粒载体pUA2B2-BS10-VP2-gpt DNA。
b.在使用前临时将所需的2 ul脂质体用48 ul无血清DMEM培养基稀释,轻轻混匀,
室温孵育5 min。
c.将a所得和b所得混合(总体积100 ul),轻轻摇动,使其混合均匀,室温孵育20 min。
(3)将上述复合物添加到用没有血清DMEM溶液洗涤1次的细胞培养孔中,轻轻摇晃,使其混合均匀,于37℃CO2培养箱中培养4-6 h。然后加入DMEM文持液,继续培养。
转染后的CEF细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养3-5 d,在荧光显微镜下观察蚀斑。 表达传染性法氏囊病毒VP2和法氏囊素三肽嵌合基因重组火鸡疱疹病毒的构建(4):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_22760.html