2.2样品处理与菌株分离

取适量的土样,在室温中自然风干，然后把土样完全的研磨成粉状，称取1g的土样在80℃下干热1个小时，加入9ml无菌的0.1%焦磷酸钠溶液，充分振荡摇匀，在28℃，200r/min条件下摇床2个小时。前期先按照10-1,10-2,10-3，10-4梯度稀释土样溶液，分别吸取100μl稀释液均匀涂布于5种培养皿上，在28℃放线菌专用培养箱中培养7-28天。后期根据分离培养基上放线菌的分离状况来选择最适的培养基和最适的土样稀释梯度。

2.3 16S rRNA基因测定与系统发育分析

用微波法提取菌株基因组DNA，扩增采用细菌通用引物，将扩增产物送到上海的生物公司进行测序，根据测序的结果，运用Blast程序从公共的数据库中查出与实验所筛选出的菌株具有高度同源性的相关菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X进行多序列比对 ，并构建系统进化树[8]。文献综述

微波法：1.吸取1.5ml的菌液于EP管中，离心后弃去上清液，取出菌体沉淀；2.依次加入900μl的洗涤液和100μl的溶菌酶，然后再加入高压蒸汽灭菌后的水使其的终浓度为2mg/ml；3将管内液体经过振荡混匀后超声30s以使菌落分散，在37℃中水浴10min或30min,涡旋振荡5s，然后于5700rpm下离心1min后弃去上清液；4.加入35μl的裂解液，振荡后微波炉加热60s，要将EP管子打开加热以防止盖子会砰开，并且要时刻听声；5.加入65℃的抽提液400ul，涡旋振荡5s，然后加入等体积酚/氯仿，1000rpm下离心 5min,加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.8000rpm下离心5min，弃去上清液，加入75%乙醇洗涤沉淀，然后于12000rpm下离心2min；7.加入20μl的TE溶解；8.加入30-50μl的水，于4℃或20℃下保藏。

2.4酶活筛选

三方面分别予以介绍：

(1）酪蛋白酶活性筛选

将待测菌株点接于酪蛋白水解培养基上，于28℃下培养7d，观察菌落周围是否存在有被分解而形成透明圈，如果有透明圈则为阳性，没有则为阴性，透明圈大小则代表了酪蛋白酶的活性强弱。

酪蛋白水解培养基[9]：脱脂奶粉50g，琼脂15g，H2O 1L，将以上培养基经115℃灭菌后再把pH值调至7.2-7.4。

(2) 淀粉酶活性筛选

将待测菌株点接于淀粉琼脂筛选培养基上，待菌株生长良好时，在菌落周围滴加上适量碘液，数分钟以后用清水洗去多余的碘液并检测有无透明圈[10]。如果菌落可以产生淀粉酶，则可将培养基中的淀粉转变为糊精或者利用吸收，遇到碘液则会形成透明圈，透明圈大小则表示了淀粉酶活性强弱。淀粉水解培养基[11]：可溶性淀粉 10g,MgSO4 1g，K2HPO4 0.3g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，琼脂 20g，H2O 1L，并将pH值调至7.2-7.4。

(3) 几丁质酶活性筛选

将待测菌株点接于胶态几丁质筛选培养基[12]上，28℃下培养，观察菌落周围透明圈形成情况及其大小。胶态几丁质制备：称取2.0g的粉状几丁质，将它放入烧杯中，缓慢的加入40ml预冷好的浓盐酸，用磁力搅拌器搅拌2h，将得到的溶液在4000r/min下离心20min，去掉上清液，收集乳白色沉淀，用蒸馏水反复冲洗至pH值为7，用蒸馏水定容至200ml，冷藏备用。胶态几丁质培养基：几丁质胶体 5.0g，NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，酵母膏 1.0g，K2HPO4 0.5g，琼脂 15g，H2O 1L，并 将pH值调至7.2-7.4。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

(4) 纤维素酶活性筛选

将待测菌株点接于纤维素水解培养基[13]上，28℃下培养7d，待菌株生长良好时，往每个培养皿中加入0.5%刚果红溶液，使溶液刚刚盖过培养皿，10min后倒掉，再往培养皿中加入1mol/L的NaCl溶液，出现透明圈的则为阳性。纤维素水解培养基：羧甲基纤维素钠 10.0g，K2HPO4 0.3g，MgSO4 1.0g，KNO3 1.0g，NaCl 0.5g，酵母膏 2.0g，琼脂 15g，H2O 1L，将pH值调至7.2-7.4。 海岸带土壤可培养放线菌的分离多样性与酶活筛选(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_77970.html