PCR 设计引物应遵循如下原则：

引物的长度一般为 15-30 个核苷酸，且在做长片段 PCR 或做某些特殊的 PCR 反应 时应使用较长的引物，但最多不能超过 50 个核苷酸；G+C 含量要以 40-60%为宜，其上 下游引物序列 GC 含量的差异不要太大；要避免引物内部出现二级结构，要避免两条引 物分子之间的 3’端有较多碱基互补，否则很容易就形成引物二聚体；要避免引物 3’端形 成发夹结构；引物的 3’端的几个碱基要以及模板 DNA 能够严格地配对，不能进行任何 修饰，否则就不能进行有效的延伸；引物应以及核酸序列数据库的其它序列无明显的同 源性；若用于克隆，引物 5’端最好加上限制性内切酶的酶切位点，而且最好是双酶切位 点，这样能够有利于定向的克隆；通常来说引物的浓度在 0。1～0。5umol/L, 适当低浓度 引物是适合的选择，这能增强 PCR 反应的特异性以及灵敏性。过高的引物浓度会增加 错配的机率，错误的引导非特异性产物的合成，而且会导致引物二聚体的形成。

（2）模板

模板 DNA 的量以及纯化程度，是 PCR 成败与否的关键性环节之一 [3]。反应物中 模板的浓度则直接影响着扩增的重复性、特异性和产量。模板过量则容易导致错配率的 升高、非特异性增大；太少则容易出现扩增的重复性不良，而且产物容易出现不足而难 以检测。来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

高质量的模板是 PCR 成功的保证, 原料中不能够混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶的抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白质。传统的 DNA 纯化通常采用 SDS 碱裂解法 和蛋白酶 K 法来消化处理标本，RNA 模板提取则一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法， 同时要防止 RNase  酶降解 RNA [4]。

（3）酶

Taq DNA 聚合酶在 PCR 反应中应用最为广泛。目前有两种 Taq DNA 聚合酶类型 供应，一种是从栖热型水生杆菌中提纯的天然酶，另一种则为大肠杆菌合成的基因工程 酶。其最适温度均为 75~80℃，催化效率达 150 NT/秒/酶分子。一般用量为 2。5～ 5U/100 μL，浓度过高很可能引起非特异性扩增，浓度过低则容易导致效率的降低，延伸不完 全 [5]。