1。8 本课题拟研究内容
本实验主要通过酶切酶连等基因克隆技术,构建受磷蛋白 PLN 的原核表达载 体,获得毫克级的高纯受磷蛋白。
2。 实验材料及方法
2。1 材料
2。1。1 菌种
大肠杆菌 BL21(DE3)作为表达的蛋白的宿主菌,DH5α作为克隆的宿主菌。
2。1。2 质粒
高拷贝的 pKS 载体用于克隆载体,pET28a 用于构建表达载体
2。1。3 工具酶和试剂盒
限制性核酸内切酶(快切酶)包括 EcoR I /Sal I 以及 DNA 连接酶 T4 DNA Ligase 等均购自 Thermo Scientific 公司。DNA 凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)和质粒小量提取试剂盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)购自 Axygen 公司。来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-
2。1。4 分子量标准
DNA 分子量标准:DL5000 DNA Marker、(购于 TaKaRa 公司 ),保存 于-20℃。
2。1。5 培养基
LB 的培养基为细菌的生长提供丰富的营养,形象的来说是细菌的肉汤。
LB 液体培养基的制备:胰蛋白胨(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,氯化钠(NaCl) 5g。该用量均是 1L 的用量。利用磁力搅拌器使其完全溶解, 然后使用二级水定容,(LB 灭菌后,在常温下储存。使用时要在无菌台打开。)
LB 固体培养基的制备:胰蛋白胨(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,氯化钠(NaCl) 5g,15g 的琼脂粉。使用:灭菌后,将 LB 固体培养基放置在
55℃的水浴中,待培养基温度降到 55℃时加入抗生素(抗生素最终浓度为:Amp
100ug/mL,Kan 50ug/mL。),是为了温度过高导致抗生素失效,并充分摇晃使其 混合均匀。然后倒板,一般 20mL 就可以倒 1 个板子。倒好后,开盖晾 10-15 分 钟。用保鲜膜封好边,并倒置放于 4℃保存,并在一个月之内使用。
2。1。6 缓冲液以及其他溶液
1×TEA buffer:在制胶过程中要使用,以及跑胶的电解槽的溶液,实验室使 用的是 5 0×TEA buffer 取 20mL,用二级水稀释到 1L,常温下储存,以备使用。
10× Green buffer:在酶切的过程中加入 DNA 中,给酶提供一个舒适的工作环境。 染料:在制胶过程中加入 1/10000 的核酸染料,实验室购置的染料化学性质稳定, 低毒性。
人肌肉浆网受磷蛋白Phospholamban原核表达与质谱分析(5):http://www.youerw.com/huaxue/lunwen_89802.html