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人肌肉浆网受磷蛋白Phospholamban原核表达与质谱分析(5)

时间:2022-02-16 21:38来源:毕业论文
1。8 本课题拟研究内容 本实验主要通过酶切酶连等基因克隆技术,构建受磷蛋白 PLN 的原核表达载 体,获得毫克级的高纯受磷蛋白。 2。 实验材料及方法

1。8 本课题拟研究内容

本实验主要通过酶切酶连等基因克隆技术,构建受磷蛋白 PLN 的原核表达载 体,获得毫克级的高纯受磷蛋白。

2。   实验材料及方法

2。1 材料

2。1。1 菌种

大肠杆菌 BL21(DE3)作为表达的蛋白的宿主菌,DH5α作为克隆的宿主菌。

2。1。2 质粒

高拷贝的 pKS 载体用于克隆载体,pET28a 用于构建表达载体

2。1。3 工具酶和试剂盒

限制性核酸内切酶(快切酶)包括 EcoR I /Sal I 以及 DNA 连接酶 T4 DNA Ligase 等均购自 Thermo Scientific 公司。DNA 凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)和质粒小量提取试剂盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)购自 Axygen 公司。来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-

2。1。4 分子量标准

DNA 分子量标准:DL5000 DNA Marker、(购于 TaKaRa 公司 ),保存 于-20℃。

2。1。5 培养基

LB 的培养基为细菌的生长提供丰富的营养,形象的来说是细菌的肉汤。

LB 液体培养基的制备:胰蛋白胨(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,氯化钠(NaCl) 5g。该用量均是 1L 的用量。利用磁力搅拌器使其完全溶解, 然后使用二级水定容,(LB 灭菌后,在常温下储存。使用时要在无菌台打开。)

LB 固体培养基的制备:胰蛋白胨(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,氯化钠(NaCl) 5g,15g 的琼脂粉。使用:灭菌后,将 LB 固体培养基放置在

55℃的水浴中,待培养基温度降到 55℃时加入抗生素(抗生素最终浓度为:Amp

100ug/mL,Kan 50ug/mL。),是为了温度过高导致抗生素失效,并充分摇晃使其 混合均匀。然后倒板,一般 20mL 就可以倒 1 个板子。倒好后,开盖晾 10-15 分 钟。用保鲜膜封好边,并倒置放于 4℃保存,并在一个月之内使用。

2。1。6 缓冲液以及其他溶液

1×TEA buffer:在制胶过程中要使用,以及跑胶的电解槽的溶液,实验室使 用的是 5 0×TEA buffer 取 20mL,用二级水稀释到 1L,常温下储存,以备使用。

10× Green buffer:在酶切的过程中加入 DNA 中,给酶提供一个舒适的工作环境。 染料:在制胶过程中加入 1/10000 的核酸染料,实验室购置的染料化学性质稳定, 低毒性。

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