透明质酸酶编码基因的克隆及序列分析(4)
时间:2018-03-23 11:48 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
（2）制备具有广泛作用的低分子量HA和寡糖。越来越多的证据表明，低相对分子质量HA及HA寡糖的生物活性与HA显著不同，近年很多研究人员都开始进行酶法降解HA制备寡糖的研究，分离纯化出单一的寡糖，从而可以进一步对其生物学意义进行研究。HAase和透明质酸（HA）是细胞外基质（ECM）的重要组成部分，HAase通过降解透明质酸破坏基底膜结构的完整性，与炎症、疤痕形成、肝纤文化形成以及肿瘤细胞的扩散联系紧密。低分子量HA可用作保湿因子用于化妆品和作为润滑剂用于滴眼液中[10]。由于透明质酸酶降解硫酸软骨素时对硫酸基的位置有一定要求，还可用于研究硫酸软骨素的结构。 （3）重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。HAase还可以作为制剂，用于临床治疗玻璃体出血、头颅血肿、肩周炎和美容等方面[11]。实际上，透明质酸酶特别是牛睾丸透明质酸酶（BTH）制剂，已广泛用于很多领域。由于疯牛病的影响，BTH制剂的应用受到限制，人们希望用微生物来源的透明质酸酶制剂替代BTH 。 （4）测定HA含量：由于S. pyogenesis噬菌体H4489A透明质酸酶特异性降解HA，且降解速度很快，李振纲等[12]试图将其用于测定HA样品的含量。通过测定酶解产物在232 nm处的特异性吸收来确定HA含量。结果表明，此方法简便易行、特异性高、价格低廉、作用迅速，其精度、灵敏度与常规咔唑法相同，并且检测结果不受HA相对分子质量的影响。 （5）治疗眼科疾病：近年来透明质酸酶在眼科手术局部麻醉，白内障及其并发症、青光眼、玻璃体视网膜疾病等方面的基础研究和临床应用报道很多，并有部分涉及甲状腺相关眼病等疾病的治疗应用情况[13]。 1.2 产透明质酸酶的微生物概述 很多革兰阴性以及革兰阳性细菌都产可降解透明质酸的酶。革兰阴性菌产生的酶存在于周质空间而不是释放到胞外，不大可能与发病机制有关，而且，这些酶类更像是软骨素酶。这些菌类有Aeromonas，Bacteroides，Fusobacterium 以及Vibrio。产透明质酸酶的革兰阳性菌有Streptococcus，Staphylococcus，Clostridium，Propionibacterium，Peptostreptococcus以及Peptostreptococcus均为厌氧菌，对其研究不多[13]。 而关于链球菌透明质酸酶的报道则很多，且深入。可产生HA的链球菌多属于A群和C群，A群由于致病性较强，较少运用于发酵生产。在链球菌A中，发现一个含有三个涉及HA合成基因的操纵子（operon），这三个基因分别命名为HasA、B、C，其中hasA负责HA合成酶的编码，而hasB和hasC则分别负责UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶的编码。C群致病性较弱，适合大规模发酵生产，多采用此类菌生产HA。主要有兽疫链球菌（Streptococcus zoopidemicus）、马疫链球菌（Streptococcus equi）、类马疫链球菌（Streptococcus equisimilis）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）。研究发现，链球菌是否产生荚膜与透明质酸酶有关，荚膜消失是由于被HAase降解[10]。根据是否产生HA和HAase，将有荚膜的链球菌C分为3类，分别为只产生HA而不产生HAase，只产生HAase而不产生HA，两者都产生。HAase的产生对HA发酵生产非常不利，在筛选菌种时，要注意菌种是否同时产生HAase[14]。 链球菌对于培养基的要求极其苛刻，由于没有TCA循环，缺乏合成大部分氨基酸和核苷酸必须的前体，因而其培养基必须富含嘌呤、文生素和超过10种以上的氨基酸。典型的生长培养基多采用葡萄糖作为碳源，并在培养基中补充小牛血或血清。Zhang[15]等的研究发现对于S.zooepidemicus NUJST01，采用淀粉做唯一碳源，不添加血清也能产生高质量的HA；在氮源的选择上，高海军[16]等认为最适宜的氮源为酵母浸膏。而冯建成[17]等认为对于Streptococcus equi SH2而言，酵母浸膏和牛肉膏以质量比2：1组成的混合氮源最利于HA的生产。 (责任编辑：qin) |