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摘  要：蓝藻是一类可以进行光合放氧的原核生物，而集胞藻6803（Synechocystis sp.strain PCC 6803）是蓝藻中的一种。与植物不同的是，蓝藻具有二氧化碳浓缩机制，对二氧化碳有更高的亲和力，因而光合作用碳反应效率相对更高。本研究以集胞藻6803基因组中参与二氧化碳浓缩的其中一个基因sll1594为靶标，PCR扩增该基因并利用Gateway技术构建重组的植物双元表达载体。我们计划通过农杆菌介导法将重组载体导入拟南芥中，并对转基因植株中该基因的表达情况和表型尤其是光合作用效率进行检测。

关键词：集胞藻6803；sll1594；二氧化碳浓缩机制；Gateway技术 

Cloning of sll1594 from Synechocystis sp. strain PCC 6803 and construction of plant binary expression vector

Abstract: Cyanobacteria are prokaryotes capable of oxygenic photosynthesis, and Synechocystis sp.strain PCC 6803 is a kind of cyanobacteria. Unlike higher plants, cyanobacteria have a special mechanism that called CO2 concentration (CCM) as well as higher affinity to CO2, leading to higher efficiency of photosynthetic carbon fixation. sll1594, one of these genes that participate in CCM, was chosen as the target in this study. This gene was amplified by PCR and the recombinant plant binary expression vector was constructed using Gateway technology. In the future, the recombinant vector would be transformed into Arabidopsis thaliana via Agrobacterium. Gene expression of sll1594 and phenotype especially the photosynthesis efficiency of the transgenic plants would be investigated.   

 Keywords: Synechocystis sp.strain PCC 6803; sll1594; CO2 concentration mechanism; Gateway technology 

 目   录

摘  要 1

关键词 1

引 言 3

1.实验材料 4

1.1 实验材料 4

1.1.1菌株 4

1.1.2质粒载体 5

1.1.2酶和试剂 5

1.1.2.1酶 5

1.1.2.2抗生素 5

1.1.2.2引物 5

1.1.2.3生化试剂及配方 6

1.2仪器设备 7

2. 实验方法 7

2.1 KAPA HIFI高保真酶PCR反应 7

2.2 PCR产物纯化 7

2.3检测PCR反应 8

2.4Gateway技术 9

2.4.1BP反应 9

2.4.2LR反应 9

2.5大肠杆菌转化 9

2.7转化农杆菌 10

3.结果与分析 11

3.1 电泳检测目的基因PCR产物 11

3.2  进行BP反应entry clone的构建 11

3.3植物转化双元载体的终载体构建 12

3.4 预期农杆菌转化（转染） 13

参考文献 14

致  谢 16

集胞藻6803sll1594基因的克隆及植物转化载体的构建

引 言 

蓝藻又称蓝细菌，是一门古老而特殊的原核生物类群，种类繁多，形态多样，在地球上的一些陆生环境和不同类型的水体（淡水、海水）中广泛分布，蓝藻属于原核生物，又叫蓝绿藻 ，蓝细菌；它属于一种最简单原始的单细胞藻类，色素均匀的分布于细胞质中，它并无细胞核，但有核物质，并位于细胞的中央，一般为颗粒状结构。蓝藻可以进行放氧型光合作用，为一种自养型生物，它也可以通过葡萄糖进行异养生存，同绿色植物一样，它具有两个光系统。它的类囊体膜上存在有藻胆蛋白体，用于吸收光能,之后再通过能量传递从而分配到光合反应中心。近些年来，随着分子生物学和基因组学研究的进展,尤其是重组DNA技术的深入应用,蓝藻的遗传基因组学方面取得了诸多成就。从而为蓝藻在光合作用研究方向提供了思路，其次为其在实际生产实践方面奠定了理论基础[10]。在光合作用过程中，蓝藻是以叶绿素a为主要色素，通过卡尔文循环固定二氧化碳，并在光合作用过程中释放氧气，蓝藻细胞的光合作用对二氧化碳具有极高亲和力，研究表明，外部环境与蓝藻Rubisco间有二氧化碳浓缩机制，（CO2-concentrating mechanism，CCM）[7]。而羧酶体是一种高效的固碳微体，在二氧化碳的浓缩机制中发挥着极其重要的作用，在蓝藻中，羧酶体作为一种类细胞器包裹了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）和碳酸酐酶（Carbonic anhydrase CA），它与无机碳转运蛋白在胞质同积累HCO3—，通过增加RubisCO周围二氧化碳浓度，从而极大的提高了固碳效率[9]，此外，蓝藻的的生长周期很短，在适宜的培养条件下，细胞倍增时间只有8~12小时，因而可便于进行各种试验。集胞藻Synechocystis sp.strain PCC 6803（以下简称集胞藻6803）是一种单细胞蓝藻，环境适应性强，遗传操作便利，是第一个完成全基因组测序的光合生物[2]，可进行光自养生长和异养生长，但该生物的很多基因的具体作用还不甚清楚。另外，在此次实验研究中，采用了gateway技术，与传统的载体构建方法不同，与其相比，通路(Gateway)克隆技术是基于λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间存在的位点特异性重组的分子机制，从该思路出发，从而研发设计出的一种新的分子克隆技术。采用该技术，通过LR反应构建目的基因的表达载体时无需经过限制性酶切和连接等一系列反应，从而极大提高了反应效率，省时反应速率快，转化效率高， 随着Gateway技术在植物基因工程研究领域逐渐深入应用,越来越多的科研机构和实验人员构建了一系列植物表达载体可用于研究某种特定基因在基因沉默，基因敲出，以及某种目的基因的组成型及诱导型表达等[11]。该研究过程中，以集胞藻（Synechocystis sp. ）PCC 6803为研究基因供体实验材料，研究该生物中的sll1594基因的相关作用，具体要根据该基因设计合适引物，以该方式合成PCR产物，即GGGG-attB1或者attB2序列，以保证在PCR扩增目的基因最终得到两端分别带有attB1/2的基因片断。之后采用gateway技术将PCR产物再与入门载体（带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列）混合，加入BP重组混合酶，于适宜条件下反应转化即可以得到含有目的基因的entry clone[18~19]。同样将entry clone于适当条件下加入LR酶进行LR反应后进行转化，完成终表达载体的构建，预期为将其通过农杆菌转化导入拟南芥后续实验操作奠定基础，最终检测受体即拟南芥光合作用效率的变化特征，包括叶绿素含量、以其它和光合作用相关的蛋白含量的变化等，预期对该基因在光合作用二氧化碳浓缩机制方面的作用提供数据资料以及科学依据，并在实际生活中的后续作用提供一定的理论参考。 (责任编辑：qin)