拟南芥液泡蔗糖转化酶基因沉默植物表达载体的构建(3)
时间:2018-03-26 17:29 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2.4 反义RNA及Dicer等酶的简介 （1） 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子。因为双链RNA不能被核糖体翻译，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译。 （2） Dicer酶存在于细胞质中，具有RNaseIII活性的核酸内切酶，是一段在生物进化过程中非常保守的序列, 是具有同源序列的RNaseIII成员之一，在促使 dsRNA 裂解为siRNA 的过程中起到关键作用。 1.3 植物表达载体的构建的研究目的和意义 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 1.4 实验相关原理介绍 1.4.1 CTAB法原理（摘自百度百科） CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十优尔烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1.4.2 聚合酶链反应（PCR）原理（摘自百度百科） PCR是一种非常有效的克隆已知基因的方法，它是模拟DNA体内复制原理的体外基因克隆技术[8]。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。 一些基于PCR 的克隆启动子技术，如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、交错热不对称PCR 等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法[9] (责任编辑：qin) |