拟南芥ABA响应启动子的克隆及驱动报告基因的植物表达载体的构建(4)
时间:2018-04-03 16:45 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
植物表达载体的构建，其要求具有以下3部分的功能结构：在T-DNA区内具有外源基因和筛选标记基因的嵌合基因；大肠杆菌的复制起始位点；细菌的筛选标记基因实际上该载体是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。微型Ti质粒和辅助Ti质粒单独存在的情况，都不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒，则可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞侵染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因中。 1.3.5报告基因 报告基因是一类编码可被快速检测的蛋白质或酶的基因。它在转化系统中由瞬间表达及稳定表达检测来确定转化的基因是否能在转化细胞中得到正确的表达，起到报告的作用。报告基因（GUS）是从大肠杆菌中分离而得到的基因，在植物体内根本不存在此基因，可以定量分析、灵敏度高等优点，因此它经常作为报告基因用于启动子的活性分析当中。 1.4实验的目的与意义 本实验用SalⅠ/XbaⅠ酶切质粒T-AtRab34，PBI101-1,连接PBI101-AtRab34，转化-提质粒-鉴定-得到载体PBI101-At34，再用SalⅠ单酶切质粒T-AtRab12，PBI101-At34（去磷酸化），连接PBI101-AtRab34-AtRab12，转化-提质粒-鉴定插入片段的方向。 第二章: 实验材料和方法 2.1 大肠杆菌感受态制备 2.1.1 实验材料 大肠杆菌（DH52）贮存菌液 2.1.2 实验试剂 LB平板，LB培养基，无菌氯化钙溶液，甘油 2.1.3 实验器具和仪器设备 器具：培养皿，无菌离心管 设备：离心机，冰箱，制冰器，振荡培养箱 2.1.4 实验方法 将大肠杆菌（DH52）贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃过夜培养。 从37℃过夜培养平皿中挑取单菌落，接种于一只装有5mlLB的30ml灭菌玻璃试管中，于37℃下振荡培养过夜。 按1％（V/V）接入新鲜的LB液体培养基。即取2ml的 大肠杆菌（DH52）贮存菌液接种于200ml的LB培养基中，温度要求37℃下，将其进行200rpm振荡培养2到2.5小时，至OD600=0.3到0.5左右，此时细菌处于对数生长期的状态，繁殖快速。 将大肠杆菌（DH52）贮存菌液加入事先预冷过的大的无菌离心管中，在冰上放置10分钟后，4℃，4000rpm的条件下离心10分钟。收集对数期细胞。 弃上清，再将菌体悬浮于1/10体积的无菌的浓度为20mmol/L的氯化钙+80mmol/L的氯化镁溶液中，再置于冰上，4℃，3500rpm的条件下离心10分钟。 弃上清，再将菌体悬浮于1/20~1/25体积的预冷过的0.1mol/L的无菌氯化钙溶液+20%甘油当中。即为感受态细胞，分装于1.5µL的离心管中，200µL/支。液氮速冻后，于-80℃冰箱保存，备用。 (责任编辑：qin) |