酵母重组系统广谱质粒的构建(2)
时间:2018-04-03 21:21 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1970年，Khorana和他的同事成功合成了丙氨酸转运RNA（tRNAala）的完整基因，这是第一次实现化学合成可遗传序列。1977年，半合成的生长抑制素基因就已经包含了许多功能，如能够诱导mRNA合成、优化密码子从而提高其异源表达能力、实现蛋白融合从而提高其稳定性、提供一个可切割位点简化从而纯化过程。寡聚核苷酸的自主合成以及PCR的引入，使得合成10kb以下的DNA片段变得更加容易，最后使人们能够合成功能性的病毒。但是在合成的过程中也会发生错误，其概率为1个/6.6kb左右。 1.1 依靠酶切酶连的DNA整合方法 近几年，依赖连接反应的方法已经能够实现将多达6个DNA片段一次整合。该实验使用44个初始DNA片段构建出33kb的DNA片段，该片段包含11个真核转录单元。定向地整合多片段DNA分子要求每一个酶连反应都和别的不同，而且连接处位于DNA模块的边缘，通常包括了启动子、5’端非转录区、信号肽、编码区以及转录终止位点。这些被编辑的连接位点可以表达翻译产生绿色荧光蛋白从而进行定量分析。 1.2 依靠同源重组的DNA整合方法 2008年Gibson等通过酵母体内同源重组的方法构建立第一个人工合成的细菌基因组。2010年Gibson等又通过这种方法将600个寡聚核苷酸整合成16kb左右的线粒体基因组。在酵母细胞内可以将多达38个片段一次性整合，由此可见，将DNA片段导入酵母细胞内，使其通过同源重组连接的方法即使是在有多个DNA片段的情况下也能够实现快速的整合。寡聚核苷酸，PCR产物，部分染色体DNA等都是都是合成起始DNA片段的便捷来源。从不同来源合成的DNA以及非合成的或合成的序列都可以实现无缝连接。至于重叠片段的构件，合成DNA可以在合成是加上，PCR产物则可以在引物5’末端加上。但是，对于大片段的整合，PCR的出错率仍然不能得倒控制，目前为止，还不知道将PCR产物控制在什么样的大小就不会出现错误。显然，如果实验需要精确的DNA片段，最好应该将PCR产物测序后再扩增，然后将这些片段导入体内进行同源重组连接。在确保大于1.5bp的PCR产物的准确性，需要依靠序列数据库（sequencing libraries）或者引物步移（primer walking）法，因此将要扩增的片段控制在1.5kb以内是很有益的。如果所需的片段一定要超过1.5kb，可以应用TAR克隆法（transformation-associated recombination），这是一个从自然中获得大基因片段的方法，并且不需要测序或者是整合PCR扩增产物，但这个方法需要酵母的辅助。这是一种效率较高的方法，2010年Gibson和他的同事将M.mycoides基因组100kb的片段与载体相连接，发现大部分的转化细胞内含有正确的序列片段。有时也需要将两个没有重叠片段的DNA片段连接起来，TAR法可以实现这一点。用含有重叠序列的引物扩增载体，从而使这两个片段先与载体相连，然后这两个片段在连接DNA作用下（DNA linkers）被整合到一起。 经实验表明，使用酵母细胞进行DNA片段的整合是非常方便的。在选择实验方法的时候，需要构建的序列大小是一方面的考虑因素，对于实验过程的控制也是需要考虑的另一方面，因为在酵母细胞中可以实现大量片段的一次性整合，这样就节省了大量的时间，因此使用酵母细胞整合是非常方便的。序列整合的次序是由同源末端决定的，并且每个片段之间的同源片段应该不同。一般同源重组要求重叠片段长度是比较长的，在20到80bp左右，因此重叠片段的之间的相似率就降低了。虽然有些时候，与重叠片段相连接的片段之间会存在较大的相似性或者为重复序列，这时就会出现错配的现象，但是，通过测序就可以筛选出正确组合的序列。通常来说，确保整合片段的长度正确就已经足够了，但是，对于重复序列或相似度较高的序列，则需要通过测序来进一步确认。然而由于整合的出现的问题十分稀少，因此可靠的解决整合发生错误的途径并没有发展起来。 (责任编辑：qin) |