番茄LeEIN2基因的克隆与沉默载体的构建
时间:2016-12-24 16:12 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
| 摘 要：在乙烯信号转导途径中，EIN2是目前鉴定到的位于受体/CTR1复合物下游的第一个正调控因子，也是该途径的一个关键因子。本研究拟构建携带EIN2的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）载体。首先提取番茄总RNA，采用反转录RT-PCR技术，克隆获得番茄EIN2基因。然后将其构建到pMD18-T载体上，进行PCR验证和测序验证。待验证结果为阳性后，再将其构建到烟草脆裂病毒（TRV）载体pYY13上，利用PCR进行初步鉴定后做序列测定。结果表明番茄EIN2基因已成功构建到目的载体中。研究成果可以为番茄EIN2基因功能验证奠定理论基础。 关键词：乙烯信号转导途径；病毒诱导的基因沉默；番茄EIN2；烟草脆裂病毒 4710 Cloning of LeEIN2 Gene and Vector Construction of Gene Silencing from Tomato Abstract: EIN2, a key factor of the ethylene signal transduction system, was the first positive regulatory factor, which located downstream of receptor/CTR1 complex. This research focuses on constructing virus induced gene silencing (VIGS) vectors of EIN2. Firstly, total RNA was extracted from tomato, and then EIN2 gene was cloned by reverse transcription RT-PCR. Secondly, EIN2 was constructed to pMD18-T vector, afterwards the recombinant pMD18-T-EIN2 vectors we constructed were successfully identified by PCR and sequencing. Finally, EIN2 was constructed to tobacco rattle virus (TRV) vector (pYY13), after that the positive recombinant pYY13-EIN2 vectors were successful by sequencing and PCR identification. The research results laid the foundation for the function research of EIN2. Key words: Ethylene signal transduction system; Virus induced gene silencing (VIGS); LeEIN2; Tobacco rattle virus (TRV) 目 录 摘 要 1 Abstract 1 引言 1 1. 材料与方法 2 1.1 实验材料及试剂 2 1.1.1 实验材料 2 1.1.2 主要试剂 2 1.1.3 主要仪器 2 1.2 实验方法 3 1.2.1 番茄RNA的提取及目的基因的扩增 3 1.2.2 pMD18-T载体与目的基因EIN2的连接反应 3 1.2.3 感受态细胞的制备和目的基因的转化 3 1.2.4 重组pMD18-T-EIN2的检测与鉴定 3 1.2.5 质粒pYY13单酶切及切胶回收纯化 4 1.2.6 质粒pYY13与目的基因EIN2的连接反应 4 1.2.7 感受态细胞的制备和目的基因的转化 4 1.2.8 重组载体pYY13-EIN2的检测与鉴定 4 2. 结果与分析 4 2.1 番茄总RNA的提取与cDNA的扩增 4 2.2 目的基因的克隆 5 2.3 重组载体pMD18-T-EIN2的PCR检测结果 5 2.4 重组载体pMD18-T-EIN2的测序结果 6 2.5 pYY13质粒单酶切 6 2.6 重组载体pYY13-EIN2的PCR检测结果 6 2.7 重组载体pYY13-EIN2的测序结果 7 3. 讨论 7 参考文献 9 致谢 11 番茄LeEIN2基因的克隆与沉默载体的构建 引言 乙烯作为一种内源性植物激素，对植物的生长发育有着重要影响，主要包括：种子的萌发、性别的分化、花和叶片的衰老与脱落、果实成熟与衰老等[1-2]。目前对乙烯的研究方向主要包括乙烯信号转导途径中基因的分离、信号转导的机理以及乙烯对植物体生长发育的调控机理等。EIN2基因处于乙烯信号转导途径的中心位置，作用于CTR1基因的下游，EIN3基因的上游。EIN2基因的突变导致乙烯反应全部丧失，说明EIN2在乙烯信号转导途径中起正调节因子的作用[3]。然而有学者研究发现EIN2不仅在乙烯信号转导途径中具有重要作用，还可能参与其它植物激素和生物与非生物胁迫因子的信号转导途径[4]。因此，明确EIN2的功能及其参与信号转导的机理，是研究植物乙烯信号转导途径的一个主要内容。 (责任编辑：qin) |