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已有研究发现在自然状态下，发现通过人为下调参与调节植物细胞周期的内源RBR 基因后，粉虱传双生病毒仍然可以侵染成熟的寄主植株。这一结果表明，双生病毒通过调节与现有发现不同的未知因子，完成了从分裂停滞期到分裂期的细胞周期转变(9)。这需要我们进行进一步的深入研究。

酵母双杂交技术是一项用来检测生物蛋白质之间是否存在相互作用的有效的技术手段，该方法利用真核微生物酵母存在与真核的高等动植物类似的代谢表达系统，来研究真核基因的功能，自其建立以来经过不断完善和提高，如今它不仅可用作检验蛋白质之间的相互作用关系，而且还能用来发现未知的新作用蛋白质和作用因子，因此广泛应用于对蛋白质组中特定途径中蛋白质相互作用网络的认识和鉴别上，成为研究蛋白质的结构与功能、蛋白质的相互作用以及发现未知互做因子的必要手段。

为了进一步研究ACMV在复制过程中的机制，明确其中起作用的未知植物内源因子或病毒因子，本研究尝试使用酵母双杂的方法来研究植物病毒各蛋白之间、病毒蛋白与寄主之间以及病毒蛋白与介体之间的互作，鉴定与AC1有关系的寄主因子，了解AC1蛋白如何与寄主蛋白相互作用的，这一研究将对我们了解植物病毒的核酸复制、基因表达调控、致病机制及与植物的互作因子认识与鉴定具有重要意义。论文网

第一章 双生病毒复制蛋白酵母表达系统的建立

引言

酵母双杂交技术是一项用来检测生物蛋白质之间是否存在相互作用的有效的技术手段，可以用来研究真核基因蛋白质的结构与功能，发现未知的新作用蛋白质和作用因子，是蛋白质相互作用认识和鉴别上的必要技术手段。

为了进一步研究ACMV在复制过程中的机制，明确其中起作用的植物内源因子，我们尝试使用酵母双杂的方法来进行相关研究。

我们希望利用酵母双杂交系统来植物病毒各蛋白之间、病毒蛋白与寄主之间以及病毒蛋白与介体之间的互作研究中，这些研究对我们了解植物病毒粒体分子结构和装配、病毒的核酸复制、基因表达调控、介体传播的分子机制、运动模式、致病机制及编码蛋白的联系图谱等具有重要意义。

材料与方法

1。 实验材料

本实验中使用病毒为非洲木薯花叶病毒（African cassava mosaic virus）即ACMV，其毒源 (DNA A 质粒为pBIN1。3A，AMP+抗性，DNA-B 质粒为pBIN2B，Tet+)。病毒质粒由杭州师范大学植物RNA信号传导中心主任洪益国教授提供。

野生型本氏烟（Nicotiana benthamiana）；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，为本实验室保存。

克隆载体 pEASY-B 购自 TransGen公司。酵母克隆表达所需载体（pGBKT7、pGADT7/Rec）以及酵母菌株AH109均购买自美国Clontech公司的Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid Library Screening System；农杆菌菌株为LBA4404质粒载体材料文献综述

图1。 用于克隆ACMV Rep蛋白的酵母双杂系统载体pGBKT7

2。 分子生物学试剂

EcoRI-HF、BamHI、HindIII等限制性核酸内切酶购于NEW ENGLISH BIOLABS； DNA Marker、T4 DNA polymerase、高保真 DNA 聚合酶、dNTP Mix、T4 DNA连接酶等试剂购于TARAKA；Agar B购于生工；2x Taq MasterMix购于康为世纪；Agrose购自BIOWEST；酶切产物回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit、PCR产物回收试剂盒High Pure PCR Product Purification Kit、质粒抽提QIAprep Spin Miniprep Kit购于QIAGEN。