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碳酸酐酶替换牛血清蛋白与 Cu SO4 结合制成纳米花，该方法是以 Cu3(PO4)2•3H2O 为骨架， 使酶固定到骨架上。

随后，Lin[9]等人使用该方法成功合成了辣根过氧化物酶-无机杂化纳米花，该纳米花与游 离酶相比活性提高了 5 倍。同时，该实验组利用胰蛋白酶合成纳米花，应用到蛋白质消化的 快速高效检测中。Zhu[10]等人使用漆酶纳米花快速检测水溶液中的苯酚，该方法的建立可用于 污水中酚类的快速检测。Xia[11]等人最近研究出一种绿色环保的酶固定化方法，他们把辣根过 氧化物酶（HRP）成功将其固定在 Mg-Al-CO3- 双层水滑石（LDHs）上，并具有纳米花的形 貌。上述的例子都表明应用这种固定化技术在酶催化、环境保护和医药领域都有光明未来。

1。3 酶催化 knovenagel 反应 随着酶学领域的高速发展，研究学者又发现，酶除了天然的催化功能外，还具有催化其论文网

他一类或者多类的反应的能力，称为酶的催化多功能性，即酶的混乱催化性[12-14]。最近报道了 一种脂肪酶催化的脱羧 Knoevenagel 反应，这是利用酶的混乱催化性催化 Knoevenagel 反应的 唯一实例[15]。例子中，CAL-B（丙烯酸树脂固定的南极洲假丝酵母脂肪酶 B）用于催化取代的 芳香醛的脱羧 Knoevenagel 反应和在 CH 3 CN / H 2O 中的β-酮酯，并且在反应过程中使用伯胺 作为添加剂形成席夫碱。虽然实验能取得较高的产率，但是此类实验必须要一些化学添加剂， 而化学添加剂常常带有毒性、易燃易爆、腐蚀性和对环境造成污染等缺点。在这里，我们希 望能报告一个新的发现，不用任何化学添加剂，使用固定化蛋白酶也可以直接促进 Knoevenagel 反应[16-19]。在何延红课题组[17]实验中，曾用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化杂环芳香醛与乙酰 乙酸乙酯、乙酰乙酮的 Knoevenagel 反应，并发现有较好的底物适应性和较高的产率，证明了 蛋白酶可以促进此类反应。由于游离酶的一些不足，使得低温或者高温，某些溶剂等环境下 不能很好地发挥催化作用，甚至会失活等。但利用新型的有机-无机杂化纳米级酶晶体不但克 服了游离酶的不足，而且还能增加游离酶本身的热稳定性，普适性等。使用酶晶体不但能直 接促进 Knoevenagel 反应，而且得到的产率还将近是蛋白酶催化产率的 1。3 倍，并且芳香，杂 芳香和 a，b 不饱和醛等都可以与较少活性的亚甲基化合物乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯反应，创 造了在绿色环保的简单系统中就能产生良好的产量的优势。

为了避免木瓜蛋白酶的热稳定性差，受外在环境如时间、介质、pH 等影响，本次实验中 使用常用的木瓜蛋白酶制成酶晶体，而酶晶体刚好能克服此类问题。此外，酶晶体首次用于   催化 Knoevenagel 反应，此类反应将可能是有机化学的潜在合成方法。

2 正文：

2。1 研究目标

木瓜蛋白酶[20]，又称木瓜酶，最适作用温度为 65℃，最适作用 pH 为 5。0，易溶于水、甘 油，不溶于一般的有机溶剂，催化能力强，作用底物专一，反应条件温和，稳定性差，在温 度、pH、溶剂等因素影响下容易变性失活。固定化后的木瓜蛋白酶能克服游离酶的不足，而 且增加了其催化活性、稳定性、连续性、可回收性等多种优点。研究历史中，大多都是利用 多种无机催化剂，或者复杂的反应系统中进行反应的，随着研究的进展，我们想利用这两种 不同的酶分别进行混乱催化，并系统的研究了几种反应条件对反应的影响，旨在能成功创造 一个绿化环保简单的体系，在此体系中就能得到很好的产物。文献综述

2。2 研究内容