生物转化2-苯乙醇辅因子NADH/NAD+的检测研究(5)
时间:2017-01-03 11:33 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
3.1.1 细胞破碎法 (1）冻融法细胞破碎 冻融法的基本原理为：细胞的膜脂在若处于低温下则它的特性会发生变化，本来细胞的膜脂是很柔的和且流动性很强，但在低温下会变脆，如果将其再融解那么膜脂就会破裂，由于时间较短细胞自身还未来得及修复。若反复进行此过程，细胞就会破裂。冻融法是把待破碎样品冷至-15到- 20℃使之冻固，然后缓慢熔化，如此反复操作，大部分细胞及细胞内的颗粒可被破碎，胞内的产物将被释放。 本实验的基本流程如下：将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；用PBS溶液清洗2~3次，加入2mL提取液（甲醇：水=4:1）混合，将菌体放于-75℃冻15min，4℃ 16100rad 10min离心收集上清液冷藏，反复3次后，将上清液用0.22um的有机相膜过滤，将待测液用液相检测。 (2）漩涡振荡破胞 旋涡混合器是利用偏心旋转使试管等容器中的液体产生涡流，从而达到使溶液充分混合的目的。该仪器特点是混合速度快、彻底、液体呈旋涡状能将附在管壁上的试液全部混均。但此法有诸多缺点：（1）细胞不能充分破碎使得NADH/NAD+不能完全释放；（2）在振荡的过程中由于玻璃珠之间的摩擦产热而破坏NADH/NAD+。 本实验的基本流程如下：将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1）混合，加入等体积的酸洗玻璃珠于旋窝振荡器上震荡30s，冰浴30s，反复10次。将得到的菌悬液于4℃ 12000rad 10min离心收集上清液，将待测液用液相检测。 (3）超声波破胞法 碎超声波破胞法是利用超声波产生独特的机械振动作用，使细胞结构发生变化，促使细胞破裂。用一定功率的超声波处理细胞悬液（通常功率为300瓦）能使细胞急剧震荡而破裂。此法多适用于微生物材料，其原理可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。同时超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种的类型等因素有关。其特点是操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。一般超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，同时也存在一些问题超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，使散热有困难，应采取相应降温措施，同时对超声波敏感和核酸应慎用，空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。由于辅酶NADH/NAD+对热较为敏感，所以在超声的过程中将样品至于冰浴中进行。 本实验的基本流程如下：将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；加入2mL蒸馏水后混合，震荡均匀后冰浴超声20min，300w，超1s停2s。将超生完的菌悬液于4℃ 12000rad 10min离心收集上清液，将待测液用液相检测。 (4）有机溶剂破胞法 有机溶剂破胞法是有选择性地加入某些化学试剂，加入的化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使胞内的物质有选择性地渗透出来的一种方法。有机溶剂破胞法的机理是因为的乙醚可以轻易的渗透到酵母细胞壁外侧的甘露聚糖孔隙间，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变甘露聚糖网状结构，从而改变细胞壁和细胞膜的通透性，在不破碎和溶解细胞的情况下使得胞内物质得以释放。 (责任编辑：qin) |