红色荧光蛋白mRuby2的优化表达(2)
时间:2018-07-10 11:01 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
重组基因的表达研究无论在基础研究中还是在应用研究中都具有重要的地位[7]。大肠杆菌里重组基因的表达研究相对来说容易进行，其结果对其它生物体的外源基因的表达有参考意义[11]。 利用大肠杆菌细胞作为表达宿主细胞、用可控诱导表达载体进行诱导表达时通常进行二步走的表达培养：先繁殖扩增细胞，然后再诱导重组蛋白质的表达。一个常用的大肠杆菌诱导表达宿主细胞是BL21(DE3)，但它在不同诱导表达重复间差异很大、稳定性不好，给表达实验观察分析、表达条件和接种方法的比较研究带来困难和不便[12]。为此本研究用较新一点开发出来的、表达稳定性更高的KRX宿主细胞进行表达研究[10]。 大肠杆菌里表达真核蛋白质一个可能的问题是蛋白质的正确折叠问题，在用BL21(DE3)表达荧光蛋白质GFP时人们建议是方法是在低温下（25-30℃）进行诱导表达。但低温悬浮培养在气温较高时不容易控制，且生长速度较慢。若能同样在37℃下进行诱导表达将给实验带来方便[4]。 上述二步走的诱导表达对于一般实验来说不是很方便，且表达效果不一定是最佳的，未必适用于所研究的重组蛋白质。为此本实验摸索探寻其它表达培养方法。我们先构建了红色荧光蛋白mRuby2的表达克隆，然后用常规诱导表达、接种环接种直接诱导表达、单菌落直接接种表达三种接种表达方法分别在24℃和37℃下二个温度的悬浮培养观察和测定荧光强度，发现37℃下的后二种接种方法的培养结果也能观察到较好的红色荧光。然后在37℃下地三种接种诱导表达方法进行了较为全面的诱导表达、激发光谱、发射光谱扫描，同时进行单点荧光强度测定探寻mRuby2表达培养的较适的接种培养方法和培养条件，以期能为其它重组蛋白质在大肠杆菌里的表达培养参考。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 载体和细胞 表达载体pRSETB、感受态细胞KRX、DH5α。 1．1．2 主要试剂 LB培养基、氨苄青霉素、鼠李糖等。 1．1．3 主要仪器 Tecan M200酶标仪、控温摇床、超净工作台、高压灭菌锅等。 1．2 方法 1．2．1荧光蛋白质表达克隆pBMR(pRSETB/mRuby2)的构建 以pFA6a-link-yomRuby2-SpHis5[2]为模板，对mRuby2进行加尾高保真PCR扩增。 扩增引物MR01： gtaagatctggCATGGTGTCCAAAGGAGAGGAG； 扩增引物MR02：gtcgaattCTTACTTATACAATTCATCCATACCACCG。 扩增产物用BglII和EcoRI切割后通过连接插入pRSETB的相应克隆位点，后得到pBMR(pRSETB/mRuby2)。连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α和表达菌株KRX。 将DH5α(pBMR)表达克隆接种至LB固体培养基进行划线纯化，37℃下恒温培养过夜后挑单菌落提取质粒。酶切验证结构正确后进行测序验证。选取都正确的质粒转化KRX得到KRX(pBMR)进行表达研究。 1．2．2两个培养温度、三种诱导表达培养方法 1.2.2.1试验培养方法1，常规诱导表达的方法 接种KRX(pBMR)单菌落于LB+Amp 50mg/L、37℃ 225rpm摇培养过夜。过夜的悬浮培养菌1:30稀释接种新鲜的LB+Amp 50mg/L、加20%鼠李糖母液使其终浓度为1%，分别在37℃和24℃ 225rpm进行诱导表达培养至生长平台期。 1.2.2.2试验培养方法2，接种环接种直接诱导表达 接种KRX(pBMR)单菌落于LB+Amp 50mg/L、37℃ 225rpm振荡培养过夜。接种一接种环的菌液于新鲜LB+Amp 50mg/L、加20%鼠李糖母液使其终浓度为1%，分别在37℃和24℃ 225rpm进行诱导表达培养至生长平台期。 1.2.2.3试验培养方法3，单菌落直接接种表达 从培养皿上挑取KRX(pBMR)单菌落于新鲜LB+Amp 50mg/L，加20%鼠李糖母液使其终浓度为1%，分别在37℃和24℃ 225rpm进行诱导表达培养至生长平台期。 (责任编辑：qin) |