基于磁珠分离技术的氯噻啉上转换荧光免疫分析方法的研究(4)
时间:2018-07-10 11:51 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
操作方法是通过调整实验参数(MNPs用量20 μL~140 μL,pH 5~9,钠离子浓度0.1~0.4 M,甲醇含量0%~10%,温育时间20 min~100 min)并用上述免疫方法进行检测。数据评估基于Fmax/IC50值,选择IC50与空白对照的荧光强度的比值是最大值时为最优。通过改变荧光强度ΔI(ΔI=I0-I,I0和I分别代表无、有氯噻啉时的荧光强度)和氯噻啉浓度对数建立标线,并计算出其抑制中浓度(IC50)[10]。 1.2.6.1 MNPs用量 改变与氯噻啉抗原标记的MNPs用量(20、40、60、80、100、120、140 μL),分别建立标准曲线,考察氯噻啉抗原标记的MNPs用量对其灵敏度的影响。 1.2.6.2 钠离子浓度 在抗原抗体反应体系中,盐离子的浓度对反应结果的影响也是很重要的,因为有盐离子存在,可以减少反应溶剂的基质效应。配置一系列Na+浓度(0.1、0.14、0.2、0.3、0.4 M)的PBS缓冲液,分别建立其标准曲线,通过标记其IC50来考察Na+浓度对其灵敏度的影响。 1.2.6.3 pH值 使用PBS溶液分别将其pH值调至5、6、7.4、8、9,然后在上述pH体系下分别建立其标准曲线,通过标记其IC50考察pH值对其灵敏度的影响。 1.2.6.4 甲醇含量 使用不同甲醇含量(0、2.5%、5%、10%)的PBS缓冲溶液配制氯噻啉标准溶液,分别建立其标准曲线,通过标记其IC50考察甲醇含量对反应体系的影响。 1.2.6.5 温育时间 改变抗体标记的UCNPs和抗原标记的MNPs的温育时间(20、40、60、80、100min),考察温育时间对反应体系的影响。 1.2.7 选择性评价(交叉反应) 选择性评价是通过交叉反应率进行比较的: CR = (氯噻啉的IC50 / 氯噻啉结构类似物的 IC50) × 100%。 配制系列浓度的氯噻啉及其结构类似物的标准溶液,结构类似物包括:噻虫啉、噻虫嗪、吡虫啉、呋虫胺、烯啶虫胺、啶虫脒。采用建立的上转换荧光免疫方法测定氯噻啉及其结构类似化合物,建立标准曲线和计算抑制中浓度(IC50),交叉反应率CR%[11]。 1.2.8 添加回收实验 添加回收实验中所使用的空白样品包括稻田水、土壤、水稻、梨、桃、小麦、番茄和小白菜均采集于南京。 稻田水(10 mL)过滤后加入已知浓度的氯噻啉标样(5,20,100 ng/mL),直接用2×硼酸盐缓冲液混合测定。 其他样品(10 g)匀浆后添加已知浓度的氯噻啉(10~500 ng/mL),加入20%甲醇的10 mL PBS提取,涡旋3 min,超声处理15 min,如此重复提取两次。4500 rpm离心5 min后,取上清液25 mL转移至容量瓶中,用PBS定容。用优化后的缓冲液适当稀释后检测氯噻啉浓度[12]。 每种样品每个浓度设3个重复并设空白对照,用优化后的方法进行检测,计算方法的回收率和变异系数。 (责任编辑:qin) |