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2。3 基因克隆

2。3。1黄瓜培养及RNA提取

将黄瓜种子放进干净的烧杯中，加超纯水漂洗15 min后去除干瘪的种子。超净台内将漂洗过的种子放进灭过菌的烧杯内，倒入10 ml 70％的酒精浸泡5 min；倒去酒精，再用10％的NaClO溶液浸泡20 min；倒去NaClO溶液，用无菌水冲洗种子5次，不时摇晃，每次2 min。将表面消毒的黄瓜种子接入pH 5。8的MS培养基，放置于28 ℃培养箱内暗培养2天，待种子露白后见光培养。

Trizol法提取黄瓜总RNA。将实验桌面、镊子、移液枪、保温瓶和刀片用75％酒精擦拭干净。剪取100 mg左右新鲜黄瓜叶片放置于已灭菌的匀浆器内，加入1 ml Trizol充分研磨。再将研磨液倒入预冷的1。5 ml离心管中，剧烈震荡混合4 min以上，室温放置6 min，再在4 ℃，12000 rpm离心10 min。吸取上层清液于新的预冷的1。5 ml离心管中，加入200 µl氯仿，剧烈摇晃5 min，室温放置至分层，4 ℃，12000 rpm离心10 min。重复上述步骤一次。吸取上层清液于新的离心管中，加入500 µl预冷的异丙醇，温和颠倒几次，室温放置约10 min，再在4 ℃，12000 rpm离心10 min。弃掉上清液，此时RNA沉淀于管底。用1 ml 75％乙醇清洗沉淀，4 ℃，12000 rpm离心5 min，室温放于超净台吹风10 min至略干燥呈半透明状。加入30 µl DEPC-H2O于管内溶解沉淀，于60 ℃恒温水浴锅水浴10 min。使用DNA酶去除RNA样品中残存的基因组DNA，如表2-1在试管中添加如下物质：文献综述

表2-1 溶解RNA的体系

全部溶解的RNA 20~50 μg

10×DNase I buffer 5 µl

DNase I (RNase-free 5 U/µl) 2 µl

RNase Inhibitor (40 U/μl) 0。5 µl

DEPC-H2O up to 50 μl

37 ℃恒温水浴30 min后加入80 µl的DEPC-H2O和等体积酚氯仿（1:1）于离心管中，混合均匀，4 ℃10000 rpm离心5 min。吸取上清液于新离心管，加入100 µl氯仿异戊醇（24:1），混匀后离心，转移上层水相。加入10 µl 3M 醋酸钠（pH 5。2）和250 µl预冷的无水乙醇于水相中，-20 ℃静置60 min，12000 rpm离心10 min获取沉淀。用70％乙醇清洗沉淀，并使沉淀干燥。加入适量的DEPC-H2O溶解，吸取1 µl用于检测RNA样品的纯度和浓度，另取2 µl跑1%的琼脂糖电泳，检测RNA的完整性。冻存于-80 ℃。

2。3。2 逆转录获取cDNA

使用SuperRT cDNA Kit，将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、RNase-Free Water和HiFi-MMLV溶化，置于冰上备用。依据表2-2配置反应所需体系，所有步骤均要求冰上操作，总体积为20 µl。

表2-2 逆转录获取cDNA的反应体系

成份 Ingredient 体积 Volume (µl) 终浓度

dNTP Mix，2。5 mM Each 4 µl 500 μM Each

Primer Mix 2 µl

RNA Template 2 µl 1 ng-5 μg

5×RT Buffer 4 µl 1×

DTT，0。1 M 2 µl 10 mM

HiFi-MMLV，200 U/μl 1 µl

RNase-Free Water 5 µl to 20 µl (责任编辑：qin)