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主要仪器：光照培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、离心机、高速台式冷冻离心机、恒温水浴锅、摇床、超净工作台等仪器。

2。3 拟南芥遗传转化及筛选

使用花序浸润法对拟南芥进行基因转化。论文网

含CsSPL9的农杆菌保存菌划线，挑取单菌落至5 ml添加了5 µL浓度为50 mg/ml的利福平（Rif）及5 µL浓度为50 mg/ml卡那霉素（Kan）的LB液体培养基中小摇，28 ℃，200 rpm振摇16 h。小摇液1:50至250 ml LB液体培养基中，添加250 µL浓度为50 mg/ml Rif及250 µL浓度为50 mg/ml 卡那霉素，大摇过夜至菌液变橙红。菌液5000 rmp离心10 min，弃上清，用浸润液（B5液体培养基，pH 5。7）250 ml重悬沉淀。重悬菌液加入50 µL表面活性剂silwet-L77，混匀后倒入灭过菌的专用皿中。植株倒置使得不成熟的花序浸在浸润液中，浸润20 s，并不停地摇晃。用吸水纸吸去茎杆上的多余的菌液，并用透光膜包包裹，然后再用橡皮筋将两头扎紧保湿，放于加入专用营养液的托盘中，28 ℃黑暗条件下培养2天，取出置于常规条件下培养。待长角果成熟后及时收取，放入干燥器2天后就可用于下一步筛选。pCAMBIA系列载体的筛选使用潮霉素（Hygromycin），筛选浓度为12。5 mg/l。抗性植株移入土中培养直至收种。收获的种子继续在含潮霉素的B5培养基上筛选，幼苗对潮霉素抗性符合3:1分离比的则为单拷贝插入。选取大于12株的抗性苗单株土培，收取下一代种子继续在含潮霉素的B5培养基上筛选培养，子代对潮霉素全抗的即为转基因的纯合株系。

2。4 转基因植株分子鉴定

2。4。1拟南芥RNA提取

转基因拟南芥总RNA的提取使用Trizol法。

将用75％酒精实验桌面、镊子、移液枪、保温瓶和刀片擦拭干净。取3~4株新鲜拟南芥幼苗放置于已灭菌的匀浆器内，加入1 ml Trizol充分研磨。再将研磨液倒入预冷的1。5 ml离心管中，剧烈震荡混合4 min以上，室温静置6 min后，4 ℃，12000 rpm离心10 min。吸取上层清液于新的预冷的1。5 ml离心管中，加入200μl氯仿，剧烈摇晃5 min，室温放置至分层，4 ℃，12000 rpm离心10 min。重复上述步骤一次。吸取上层清液至新的离心管，加入500 μl预冷的异丙醇，温和混匀，室温放置约10 min，4 ℃，12000 rpm离心10 min。弃掉上清液，此时RNA沉淀于管底。用1 ml 75％乙醇清洗沉淀，4 ℃，12000 rpm离心5 min，室温放于超净台吹风10 min至略干燥呈半透明状。加入30 μl DEPC-H2O于管内溶解沉淀，于60 ℃恒温水浴锅水浴10 min。使用DNA酶去除RNA样品中残存的基因组DNA，在试管中添加如下物质：

全部溶解的RNA 20~5μg文献综述

10×DNase I buffer 5 μl

DNase I (RNase-free 5 U/μl) 2 μl

RNase Inhibitor (40 U/μl) 0。5 μl

DEPC-H2O up to 50 μl

37 ℃恒温水浴30 min后加入80 μl的DEPC-H2O和等体积酚氯仿（1:1）于离心管中，混合均匀，4 ℃10000 rpm离心5 min。吸取上清液于新的离心管，加入100 μl氯仿异戊醇（24:1），混合均匀后离心，转移上层水相。加入10 μl 3M 醋酸钠（pH 5。2）和250 μl预冷的无水乙醇于水相中，-20 ℃静置60 min，12000 rpm离心10 min获取沉淀。用70％乙醇清洗沉淀，并使沉淀干燥。加入适量的DEPC-H2O溶解，吸取1 μl用于检测RNA样品的纯度和浓度，另取2 μl跑1%的琼脂糖电泳，检测RNA的完整性。冻存于-80 ℃。