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2。2。3抑菌谱研究

分别以大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌指示菌、白色念珠菌、链格孢菌、扩展青霉、黑曲霉为指示菌，用牛津杯法测定蝉花多糖的抑菌活性。

2。2。3。1细菌指示菌

①指示菌的活化:将指示菌分别在LB平板培养基活化，无菌操作挑取活化的菌落扩大培养后接入LB液体培养基，选择合适的条件于恒温摇床培养。

②指示菌平板的制备：待LB培养基冷却到50℃时，按照2。0 %的接种量，以无菌操作法分别取指示菌的菌液至LB培养基中，摇匀后倒平板。

③抑菌实验：在平板上用笔做好标记，用灭过菌的镊子将灭过菌的牛津杯放在酒精灯上烧一烧，然后在水平放置的平板中轻轻并且均匀地放置2只牛津杯，用微量移液枪吸取蝉花多糖溶液200 μl 至牛津杯中，对照组中加入200 μl的无菌水。于4℃冰箱放置3h，待样品完全渗入培养基后，于37 ℃恒温培养箱中培养24h，实验重复3次。

2。2。3。2真菌指示菌

①指示菌的活化:将指示菌分别在PDA平板培养基活化，无菌操作挑取活化的菌落扩大培养后接入沙氏液体培养基，选择合适的条件于恒温摇床培养。

②指示菌平板的制备：待PDA培养基冷却到50 ℃时，按照2。0 %的接种量，以无菌操作法分别取指示菌的菌液至PDA培养基中，摇匀后倒平板。

③抑菌实验：在指示菌平板上用笔做好标记，用灭过菌的镊子将灭过菌的牛津杯轻轻并且均匀地放在指示菌平板中，用微量移液枪吸取蝉花多糖溶液200μl至牛津杯中，对照组加入200 μl的无菌水。小心于4℃冰箱放置3h，待样品完全渗入培养基后，于28 ℃恒温培养箱中培养48h，实验重复3次。

2。2。4最小抑菌浓度测定文献综述

采用连续二倍稀释法稀释蝉花多糖，用比浊法[8]测定最小抑菌浓度，蝉花多糖的最小浓度定为其对该指示菌的最小抑菌浓度（MIC）。首先制备过夜培养的指示菌菌液，实验组分别在试管中加入2。0 ml不同浓度的蝉花多糖溶液和0。10 ml菌液，对照组加入2。0 ml不同浓度的蝉花多糖溶液和0。10 ml无菌水，空白管加入2。0 ml无菌水和0。10 ml菌液，将试管于37 ℃，200 r/min摇床中培养4 h，以各浓度的对照管为空白，于600 nm处测各管吸光值，根据公式计算抑菌率。实验重复3次，抑菌率为正值的最小多糖浓度即为其MIC。

抑菌率（%）= (1-AX/A0)×100

式中AX为实验组测得的吸光值，A0为空白管的吸光值。

2。2。5蝉花多糖对指示菌生长曲线的影响

 取对数期的指示菌菌液（OD600约为0。80）按2。0 %的接种量接种于100 ml LB液体培养基中，加入5。0 ml蝉花多糖溶液，于37 ℃，200 r/min摇床发酵培养，分别取发酵培养0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24 h的菌液用分光光度计测OD值，以培养时间为横坐标，菌液OD值为纵坐标，绘制生长曲线。对照以无菌水代替多糖溶液，实验重复3次。