拟南芥SEC6基因在主根细胞程序性死亡中的功能初步研究(3)
时间:2018-07-17 20:53 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
氧可激活根皮层细胞中的乙烯生物合成途径，使ACC合成酶和ACC氧化酶的活性上升， 引起乙烯跃升，从而触发了乙烯介导的 PCD 信号传导途径，引起细胞凋亡[16]。虽然单独的乙烯不足以触发 PCD，但相关的氧化爆发诱导的细胞死亡可以通过抑制乙烯信号传导阻断[17]。 本文以拟南芥 exocyst 复合体亚基 SEC6 基因表达下调突变体 PRsec6-1 为材料，对 exocyst 亚基SEC6 在主根细胞发生程序性死亡过程中的功能进行研究。 1 材料与方法 1．1 实验材料 1．1．1 植物材料 野生型拟南芥的种子 Columbia(Col-0)由Arabidopsis Resource Center 提供，经本实验 室繁种，变色硅胶脱水长期保存于 4 度冰箱中，拟南芥 T-DNA 插入突变体 sec6-1/+购 自拟南芥生物资源中心 ABRC，为 Col-0 型。PRsec6-1 突变体是由本实验室在 sec6-1/+ 突变体基础上自行构建。本研究中使用的 PRsec6-1 ein2-5、PRsec6-1 rbohD、PRsec6-1 npr1 等种子材料是由本实验室在 PRsec6-1突变体基础上分别与ein2-5、rbohD、npr1 等 突变体marker杂交获得。 1．1．2 酶、试剂及各种化学药品 1．酶：本研究中所使用的普通DNA聚合酶Mix 为近岸蛋白质科技有限公司产品；RNA 反转录酶等为TaKaRa 产品；高保真DNA聚合酶购于TOYOBO公司； 2．试剂盒：PCR 产物回收试剂盒（DP204-03）为 Axygen 公司产品，普通质粒小提试剂盒为Sigma公司产品； 3．提取RNA试剂RNAiso Plus 购自Takara 公司；琼脂糖购自 Biowest 公司；其它化学 药品为进口或国产分析纯试剂，略； 4．本研究中的引物合成服务主要由生工提供，序列测定服务由生工或思普金公司提供。 5．抗生素：本研究中所用抗生素见表 1-1。 表 1抗生素 Table 1 antibiotics 抗生素名称 简写 溶剂 来源 母液浓度 终浓度 氨苄青霉素（Ampicillin） Amp 水 Sigma 50 mg/mL 50 μg/mL 卡那霉素（Kanamycin） Kana 水 Sigma 50 mg/mL 50 μg/mL 潮霉素（Hygromycin B） Hyg 水 Roche 50 mg/mL 25 μg/mL 利福平（Rifampicin） Rif DMSO Roche 50 mg/mL 100 μg/mL 1．2 实验仪器 PCR 仪为Bio-Rad 公司的 PTC-100型。 电泳槽和电泳仪分别为南京大学普阳仪器研究所生产的 DYY-33A型和DYY-6C 型。 凝胶成像系统为Bio-Rad 公司的紫外扫描仪。 普通离心机为Eppendorf 公司的5418型，低温离心机为 Eppendorf公司的 5418R 型。 普通光学显微镜以及荧光显微镜为 LEICA 公司的 Leitz DM2500型。 体视显微镜为Nikon公司的 SMZ1500 型。 普通共聚焦显微镜为 Carl Zeiss 公司的 LSM710 META。 实时定量荧光PCR 仪为 Applied Biosystems 公司的 7300/7500 Real Time PCR System。 1．3 实验方法 1．3．1 拟南芥的栽培与管理 拟南芥成熟种子（约 50 粒/毫克）置于次氯酸钠溶液（次氯酸钠：水=1:8）中浸泡 7-8min 进行表面消毒。为使种子与消毒液充分地接触，其间将离心管置于涡旋仪上涡旋。 然后，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水清洗种子 4-5次，悬于无菌水中，将其播种于普通 MS 培养基或者相应的筛选培养基中。在 4℃条件下低温避光春化处理两天后放入光照 培养箱或生长室中培养，7天后将小苗移栽到土中。 生长室的培养条件为：光照强度 50 μmol· m-2，长日照条件16 h光照/8 h黑暗， 相对湿度60~70%，温度 18~22 ℃。移栽土壤的配方为营养土和蛭石按 1:7 混匀使用。 (责任编辑：qin) |