褪黑素通过减少镉吸收和增加抗氧化物能力提高生菜镉耐性(3)
时间:2018-07-17 20:59 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
溶液，3 min后测 OD595吸光度。可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000).C 是标准曲线查得的蛋白质含量（μg） ；VT为提取液总体积（稀释后的体积 ml） ；VS为测 定时所用提取液体积（ml，20 μl） ；W为样品鲜重（g） 。 1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 酶液制备：取 0.2 g 叶片或根，用蒸馏水洗净，再用吸水纸将水分吸干，然后置于 早已在冰上预冷的研钵中，加入 1.6 ml 50 mmol/L预冷的磷酸缓冲液，在冰上研磨成匀 浆，将匀浆导入离心管中，在4 ℃、12000 g 条件下离心 20 min，所得上清液即为酶液。 酶活性测定： （1）反应混合液配制：分别取 Met 溶液 162 ml，EDTA-Na2 溶液 0.6 ml， 磷酸缓冲液5.4 ml，NBT溶液6 ml，核黄素溶液6 ml,混合后摇匀； （2）把30 μl 的酶液 加入的到试管中，在向其中加入3 ml 反应液（3）光照反应 20 min，光强为 4000 lux， 然后在避光条件下测定 OD560 酶活性计算： SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD 总活性/蛋白质含量 SOD总活性单位为（u/g FW） ；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack 为对照 管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样液总体积（ml,1.6 ml，加入 PBS 的体积)； Vt 为测定时的酶液用量（ml，30 ul） ；W 为样品鲜重（g， ） ；蛋白质含量单位为 mg/g。 1.2.5 过氧化物酶（POD）活性测定 参照Rao[5] 的方法 1.2.6 过氧化氢酶（CAT）活性测定 参照Rao[5] 的方法 1.2.7 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定（缓冲液为 K） 酶活性的测定（以 2 ml 体系测定） ： 取0.10 ml 酶液， 加入1.7ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS （PBS为0.05 mol/L， pH7.0） ， 再向其中加入 0.1 ml 5 mM 的 AsA，最后加入 0.1 ml 20 mM H2O2，立即在20 ℃下测定 OD290值在40 s 内的变化 计算公式： ᇞOD/ᇞt×Vr×VT A×d×Vt×W ᇞOD为反应时间内吸光度的变化； ᇞt为反应时间， 为40 s； Vr为反应液体积为2 mL； VT提取液体积， 为 1.6 mL； A为消光系数， 为 2.8 mM-1 .cm-1 ； d 为比色杯厚度， 为 1 cm； Vt 测定液体积，为 0.1 mL；W为样品鲜重，为 0.2 g。 1.2.8 丙二醛（MDA）含量测定 首先先将研钵冰浴， 再向研钵中加入5 ml 10% 三氯乙酸研磨， 4000 ×g离心 10 min， 上清液为样品提取液，吸上清 2 ml（对照加 2 ml 蒸馏水） ，加入 2 ml 0.6% TBA（用10% mM TCA 配置） ， 混匀物置于水浴反应15 min， 迅速冷却后再离心。 离心后取其上清液， 分别测定 532、600、450 nm波长光密度。MDA=6.45(D532-D600)-0.56D450 1.2.9 H2O2 含量的测定 采用 Velikova（2000）方法，称取一定量的鲜样，加入5 ml 0.1%（W/V）TCA冰 浴研磨， 12000×g离心15 min， 上清液供测试。 取0.5 ml 提取液， 加入0.5 ml 10 mM pH7.0 PBS，1.0 ml KI，摇匀。将溶液置于390 nm 波长下比色测定。同样程序制作标准曲线。 1.2.10 镉含量的测定 分别称取0.1 g 地上部和地下部干样，于2 ml HNO3+8 ml H2O的体系中进行微波消 解 35 min，随后用去离子水将消解液定容至25 ml 备用。用 5% HNO3 配制 Cd 的标准液 于 ICP-MS（Optima 2100DV, PerkinElmer Waltham, MA, USA）下测定镉含量。 1.3 数据分析与处理方 实验数据用 Excel 表格建立数据库，分析用 SPSS 6.0 中邓肯多差距实验中的 one-way ANOVA 的方法分析不同处理间的差异，其显著性在P＜0.05 水平上。用 Graph Prism v5.0 进行作图。 (责任编辑：qin) |