解淀粉芽孢杆菌SQR9根际互作微生物的初步鉴定(3)
时间:2018-07-17 21:22 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1．2．2 黄瓜根际土菌体细胞的提取 采用多次匀浆-差速离心法[17]提取根际土中菌体细胞：10 g新鲜土壤用100 ml 0.2% 焦磷酸钠溶液重悬，2,200 rpm匀浆处理60 s 3个循环，间歇冰浴，防止过热。土壤匀浆液加0.2 %焦磷酸钠溶液稀释到500 ml，1,000 g离心10 min，使菌体与土壤初步分离。沉淀重新匀浆60 s，低速离心，重复3次，合并上清，12,000 g离心20 min，弃上清，沉淀用50 ml PBS 缓冲液重悬，即为根际土菌体细胞悬液，4 ℃暂时保存。 1．2．3 生物膜共培养[5] 将过夜活化的菌株SQR9接种于无菌LB液体培养基中，37 °C，170 r*min-1培养至对数生长期，OD600约为1.0。离心收集菌体后，用等体积的MSgg液体培养基重悬菌体。生物膜培养采用24孔细胞培养板，板上放置24孔滤网，在培养孔中加入0.5 ml MSgg培养基，1 ml PBS缓冲液，菌株SQR9悬液20 μl，0.5 ml根际土菌体悬液或0.5 ml PBS缓冲液作对照，于37 ℃静置培养24 h。 1．2．4 提取生物膜和培养液中的DNA 取出24孔滤网，生物膜残留在滤网上，在新的无菌24孔细胞培养板上加2 ml PBS缓冲液，放入24孔滤网洗涤生物膜，去除游离细胞，重复洗涤3次，6个培养孔的生物膜的合为一个生物膜样品，并收集剩余培养液及生物膜洗涤液作为游离细胞样品，分为菌株SQR9生物膜、菌株SQR9加黑土生物膜、菌株SQR9游离细胞、菌株SQR9加黑土游离细胞4个处理，每个处理3个重复。样品用PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio）土壤DNA提取试剂盒提DNA。 (责任编辑：qin) |