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1。5  ATMT法简介

1998年，一种基于土壤农杆菌的转化方法在植物转化体系中被发现，之后利用改法成功实现了丝状真菌的转化。农杆菌（Agrobacterium）属于土壤杆菌属，革兰氏阴性细菌 [9]，其中根癌农杆菌和发根农杆菌与基因转移有关，可侵染植物的受伤部位，导致冠瘿瘤和毛状根的发生。农杆菌中与侵染有关的组分是游离于基因组以外的被称为Ti质粒的双链DNA。Ti质粒上有两个区域参与了基因转移，分别为T-DNA（转移DNA）区和Vir（毒性区）区。T-DNA约为25kb，其上携带有tms、tmr、tmt三套基因，分别编码植物生长素，分裂素以及可催化产生冠瘿碱的物质，是致使冠瘿瘤发生的主要原因。这些基因与转移无关，因此可用其他基因进行替换。T-DNA序列位于两个不完全直接重复的保守序列之间，左端的序列称为左边界（Left-broder），右端称为右边界（Right-broder）。这两端长为24bp左右的序列是T-DNA转移不可缺少的。且右端序列相较于左端序列更为重要。右端序列突变将导致转移功能消失或降低。Vir区大约为35kb，其上的基因并不能转移到植物基因组中，但却是T-DNA发生转移不可缺少的。这段区域包含有7个操纵子，24个基因。利用这一特点构建双元载体系统，其中一个为含T-DNA区段的DNA转移质粒，另一个为含T-DNA转移所必要的vir区段的质粒（Ti辅助质粒）[10]。在引发T-DNA转移机制后，存在于这些边界重复序列之间的任何DNA都会以单链DNA分子的形式被随机转移到宿主基因组中。

1。5。1   ATMT法特点

对大多数真菌来说，ATMT法转化效率更好。一些无法用传统方法转化的真菌，可以用ATMT法实现转化；ATMT法的另一个优点是转化受体多样性，该法的转化受体包括分生孢子、原生质体、营养体和菌丝体。另外，T-DNA以单拷贝整合进宿主基因组，造成单拷贝插入突变。当宿主与T-DNA之间没有同源性时，T-DNA可以一种随机插入方式进行整合。这种转化系统适用于对基因内部突变基因的研究。最后，T-DNA整合进宿主染色体中后能够随染色体的复制而复制并遗传给后代，因此可保持较高的遗传稳定性[11]。

  1。5。2 影响ATMT法转化效率的因素：文献综述

乙酰丁香酮浓度：共培养阶段加入乙酰丁香酮对诱导vir基因的表达是必须的。预培养阶段可选择性加入乙酰丁香酮。对某些真菌而言，预培养阶段加入乙酰丁香酮不影响转化子数目，但对其他真菌，不加入乙酰丁香酮则会降低转化效率。方浩等[12]的实验表明，共培养pH为5，温度为24℃时，乙酰丁香酮浓度越高，转化率越高，当浓度高于200umol/L时，转化率不继续增加。转化受体：ATMT法可使用的转化受体有分生孢子，原生质体，菌丝体或真菌体组织。其中，以分生孢子作为转化受体，获得的转化子更多，过程更简便；而原生质体的获得需要使用细胞壁水解酶水解细胞壁；萌发的孢子导致高水平真菌本底生长，降低转化率。刘刚等[11]在研究不同转化受体对转化效率影响的实验中证实，采用原生质体作为转化受体是转化效率最高。但原生质体的制备较为繁琐，因此多以孢子作转化受体。土壤杆菌菌株：不同的土壤农杆菌菌株已被成功用于获得转化子，这些菌株包括A348，LBA1119，LBA1126等，对每种菌株而言，最佳共培养条件是不同。共培养条件：共培养的温度，时间pH及农杆菌与孢子的浓度比对转化效率都有影响。有实验表明，共培养温度在20-28℃，共培养时间在16-96h之间可获得转化子。转化子的获得要求较低pH（5。4-5。6）