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2 材料与方法

2。1 实验材料

供试油菜（甘蓝型）播种于淮阴师范学院科技园，待油菜成熟晾晒后，剥出籽粒备用。

2。2 实验用品

实验操作所需的离心管、枪头、蓝盖瓶、量筒、研钵、研杵、药匙等经高温高压灭菌烘干后用0。1% DEPC浸泡处理24h后再高温高压灭菌2次，研钵、研杵和药匙放在180℃烘箱中烘6h。电泳槽、制胶板、梳子等清洗干净后再用DEPC处理过的无RNA酶的水冲洗2遍，使用前分别用75%的乙醇、10%和0。1%的RNA酶固相清除剂先后处理5min，最后用DEPC处理过的无RNA酶的水清洗3次用于制胶。

2。3 实验试剂   

RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司（产品目录号为DP437-02）；β-巯基乙醇、50×TAE Buffer、RNase-free ddH20均购自上海捷瑞生物工程有限公司；康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒CW2598M、DNaseⅠ、固相清除剂、Gold View、DEPC水均购自康为世纪生物科技有限公司。 

2。4 油菜种子总RNA提取方法

2。4。1 试剂盒提取RNA法

     采用的试剂盒分别为天根生化科技公司生产的植物总RNA提取试剂盒RNA plant plus reagent和康为世纪的全能型植物总RNA提取试剂盒CW2598M，操作方法分别按照各公司的说明书进行。

2。4。2 基于两种试剂盒改良法文献综述

    将天根试剂盒和康为试剂盒相结合，并对试验步骤进行优化，具体步骤如下：

1）取0。1g成熟油菜种子放入已经使用液氮预冷的研钵中，并迅速研磨成粉末状。

2） 将粉末迅速转入至2ml的离心管中，并迅速加入800μl含有β-巯基乙醇的RNA plant plus reagent提取液，涡旋震荡至彻底混匀，离心管平放静置5min。

3）室温下离心管平放静置5min后，加入200ul氯仿，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温放置5分钟，4°C 13,000 rpm离心10分钟。

    4）将上清转移至新的RNase-Free的2ml离心管中（约400ul），缓慢加入1/2体积的无水乙醇（约200ul），颠倒混匀，将混合液和沉淀一起转入康为世纪CW2598M试剂盒自带的吸附柱RM（Spin Columns RM with Collection Tubes）中，4°C 13,000 rpm离心2分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5）向吸附柱内加入80μl康为世纪CW2598M试剂盒自带的DNase Ⅰ液，室温下反应5分钟。

6）向吸附柱内加入350μl康为世纪CW2598M试剂盒自带的Buffer RW1 ，4℃13,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7）向吸附柱内加入600μl康为世纪CW2598M试剂盒自带的Buffer RW2 ，4℃13,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8）将含有吸附柱的收集管重新放回到离心机，4℃条件下13,000rpm离心1分钟，充分去除吸附柱中残余乙醇。