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成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。 根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用[2] 。论文网

论文论述了关于鸽嗉囊成纤维细胞的培养技术，如嗉囊的取材，细胞的接种鉴定等。成纤维细胞在生长过程中能够分泌一些生长因子促进上皮细胞等其它细胞的生长，因而常作为滋养层细胞与上皮细胞共培养。本课题将对鸽嗉囊成纤维细胞体外培养建立方法，为今后研究鸽嗉囊成纤维细胞与上皮细胞之间的相互作用以及嗉囊上皮细胞形成鸽乳物质的机理打下基础。

2  材料与方法

2。1  材料

2。1。1  实验动物

发育状态良好的2日龄雏鸽（幼年鸽子）。

2。1。2  试剂及仪器 

细胞培养液、胰蛋白酶消化液、磷酸缓冲液、Vimentin 一抗（兔原多克隆抗体）、二抗（羊抗兔多克隆抗体）、封闭液、CO2培养箱、显微镜、离心机 、酶标仪、25mL培养瓶、载玻片、盖玻片等。

2。2  鸽子嗉囊的采集 

实验采用幼年鸽子，用剪刀剪去鸽舌放血后等其死去。嗉囊位于鸟类食道的中部或下部的，一个能与食道区分开的膨胀部。用75%酒精消毒食道的中下部，打开胸腔取出嗉囊，置于无钙镁离子的PBS中在超净遍工作台用高浓度双抗溶液清洗5遍[3]。

2。3  鸽嗉囊成纤维细胞的分离和原代培养   

2。3。1  胰蛋白酶消化法

（1）将组织剪碎放入盛放胰蛋白酶消化液的离心管中，消化15min其间振荡数次。（2）加入完全培养液终止消化。（3）将消化后的细胞悬液过滤除去黏液和未消化的组织得到细胞悬液。（4）将细胞悬液转移至含10mL的PBS溶液离心管中静置10min。（5）离心10min,离心结束后弃去上清液。（6）用培养液混悬细胞，调整细胞密度为2×105，以0。5mL/每孔接种于培养板中置入培养箱中培养[4~8]。

2。3。2  组织块贴壁法

（1）将组织剪成1平方厘米大小的组织块用吸管将其接种于25mL的培养瓶中，让瓶的底部朝下，放于37摄氏度恒温培养箱培养2小时。（2）拿出培养瓶，翻动培养瓶让瓶底朝下，缓慢加一些培养液约5mL，于37摄氏度饱和湿度条件下培养，每隔2天更换一次培养液，每隔12小时观察细胞形态 [9~11]。

3  MTT细胞增殖   文献综述

胰酶消化法得到的鸽嗉囊成纤维细胞，调整细胞密度为2×104个/ml，每组设3个重复，每个重复6 孔，每孔加入 100 μL 含细胞的完全培养液。分别在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天用MTT增殖法测定各组细胞增殖情况，具体方法如下：以20 μL/孔MTT （噻唑蓝）加入到96 孔板中，将96 孔板放入二氧化碳培养箱，孵育4 h 后，将孔板置于超净台，加入 150 μL/孔二甲基亚分（DMSO），室温振荡 15 min，用酶标仪检测其吸光值（OD490nm）[12]。   

4  鸽嗉囊成纤维细胞的鉴定 

取传2代成纤维细胞以105个接种于放有无菌盖玻片的6孔板，两到三天后用0。01mo1/LPBS洗三次，每次两分钟；40g/L多聚甲醇固定20分钟，倒掉甲醛0。01moL/LPBS洗三次，每次5分钟；加封闭液室温封闭60分钟，用0。01mo1/LPBS洗三次，每次5分钟；滴加稀释400倍兔原多抗Vimentin一抗，在4摄氏度条件下过夜，用0。01moL/LPBS洗三次，每次5分钟；然后加Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG二抗200μL，室温避光孵育1小时，用0。01mo1/LPBS洗三次，每次5分钟；最后滴加ProLong Gold和DAPI溶液；在荧光显微镜下观察阳性细胞 [13]。 (责任编辑：qin)