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2。2纤维素酶复合体的组成及功能论文网

纤维素酶是指降解纤维素的一组酶的总称，其不是单个酶，而是起协同作用的多组分复合酶系。纤维素酶主要由3种酶组成：内切型-β-葡聚糖酶（EC3。2。1。4），外切型-β-葡聚糖酶（EC3。2。1。91，也称纤维二糖水解酶）和纤维二糖酶（EC3。2。1。21，也称β-葡萄糖苷酶）[11]。纤维素酶特异性高，反应条件简单，降解过程中不会产生环境问题等，是成为将纤维素和半纤维素转化成葡萄糖的霉菌的主要优点。纤维素酶和一般酶反应不一样，其主要区别在于纤维素酶是多组分酶系。在水解纤维素为葡萄糖的过程中，须依靠不同组分之间的协同作用才能完成。大分子首先在内切葡聚糖酶的作用下产生新的游离末端，然后由外切葡聚糖酶在新产生的还原端或非还原外切纤维素链，生成纤维素二糖（或葡萄糖），再由β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖生成两个葡萄糖[4]。目前，纤维素酶的产酶菌株的活力还不是很高，致使其生产成本过高，限制了其进一步的应用[10]。所以，制约纤维素转化为生物乙醇的主要障碍是酶解成本过高，其占总生产成本较大一部分，只有将酶的生产成本降低，生物乙醇才有可能与石油竞争。纤维素酶的生产是成功的酶促转化纤维素生物质为生物乙醇的重要因素之一。因此，选育出高产纤维素酶且酶活性稳定的产酶菌株至关重要。

2。3β-葡萄糖苷酶Bgl3a

根据氨基酸序列分类，β-葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1和3中。通过基因组信息表明，丝状真菌中β-葡萄糖苷酶一共含有11个编码基因。Bgl3a属于糖苷水解酶第3家族。其中发现过表达Bgl3a的菌株在纤维素诱导条件下，纤维素酶基因的表达水平提高,但是若缺失此基因，纤维素酶基因诱导表达会迟缓[5]。所以β-葡萄糖苷酶Bgl3a这个基因对于有效提高纤维素酶的效率有重要的影响。

2。4β-葡萄糖苷酶Bgl3a的克隆

通过设计扩增β-act的启动子和Bgl3a的引物，启动子和引物经过PCR扩增，利用overlapping PCR 将两者连成一个片段得到Pact-Bgl3a，连成的片段连接到pCAMBIA1300二元质粒里,用酶切和测序的方法确定Bgl3a克隆是否成功[6]。实验中用于作为正对照的质粒Bgl3a-pCAMBIA1300就是以里氏木霉的DNA为模板，通过设计扩增β-act的启动子和Bgl3a的引物，经过PCR扩增，利用重叠反应将两者连成一个片段Pact-Bgl3a，并将Pact-Bgl3a酶切后连接到pCAMBIA1300二元质粒上，用酶切和测序的方法来确定Bgl3a克隆[13]。

3。材料与方法

3。1。菌株与质粒

菌株：里氏木霉T。 reesei RutC-30、根癌农杆菌、Bgl3a-pCAMBIA1300二元质粒均由淮阴师范学院生命科学院研究室保存。

3。2。培养基文献综述

农杆菌培养液体培养基是LC（8g Nacl ,10g Tryptone ,5g yeast extract定容至1L），加卡那和利福平分别为100μg/m和2。5μg/ml。

根癌农杆菌的诱导培养基为IM培养基：

(K2 HP04 10mmoL/L 2。28g、KH2 P04 10mmoL/L 1。36g、NaCl  2。5mmoL/L 0。1463g、MgS04 2mmol/L  0。493g、CaCl2 0。7mmol/L  0。077g、FeS04 9μmoL/L 0。25g/100ml取1ml、(NH4)2S04 4mmol/L  0,528g、葡萄糖 10mmoL/L  1。98g、甘油50%取10mL、AS 200μmoL/L  5μL，琼脂的浓度分别为1。5%和0。7%。）

RutC-30平板培养基为PDA培养基

PDA培养基：200g土豆切成1cm的块状，用自来水煮开，用玻璃棒轻轻一碰就碎即可，用纱布过滤取得液体，加入20g葡萄糖，15g琼脂，定容至1L。