Drosophila Drosha的克隆与表达(3)
时间:2018-07-26 20:12 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.2.4 转化 往连接混合溶液中加入40-50μl感受态细胞，冰上放置15min，42℃热激40s，立即冰浴2min；加入150-200μl LB液体培养基，37℃恒温摇床中培养45min-1h，缓慢将菌液滴入37℃预热后的固体LB培养基上，取灭菌后的玻璃珠均匀涂板，至培养基表面无明显液体残留；37℃温箱培养16h。 1.2.5 菌落PCR 在无菌环境下挑取多个重复（一般选5-10个克隆作为一组重复），每一个克隆都用一定量的无菌水稀释；取灭菌后的PCR管，将菌液、PCR buffer和两种引物（根据特定的PCR反应确定buffer和引物的类型和用量）按照特定实验中的比例加入到准备好的PCR管中，设置好阴性对照（根据核酸电泳结果可以判断试剂中是否存在核酸污染），放入PCR仪中进行PCR反应。 1.2.6 核酸电泳 配置1.2%的核酸胶，称取0.4g琼脂糖粉末倒入制胶的专用瓶中，加入35ml TAE buffer（1×），放入微波炉中加热至胶溶液无色透明；将胶槽洗净，根据具体的实验需要插入相应的梳齿；将胶放置在微波炉外冷却，至不烫手时加入2μl EB，混匀，沿着胶槽壁缓慢倒入胶槽中，使得胶体没过梳齿下沿且胶体与胶槽之间没有气泡，冷却至胶体凝结为固体；将marker（视具体核酸大小而定）、PCR产物依次加入点样孔中，进行电泳；电泳结束后，在紫外凝胶观察仪下观察结果。 1.2.7 切胶回收 本实验使用BIOMIGA公司的Gel/PCR Extraction Kit进行切胶回收。从凝胶上切下带有目的片段的凝胶块到一个1.5ml或2ml的离心管中，加入1倍体积的Buffer GC（称量或者估算凝胶的重量，确保加入不少于1倍体积的Buffer GC），置于55℃~60℃水浴中加热8~10分钟，期间颠倒混匀几次，直至凝胶块完全溶化，冷却离心管至室温；转移以上混合液（每次不超过700μl）至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000xg离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复，直至剩余的混合液全部通过吸附柱；加入500μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温13,000xg离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复1次；室温13,000xg将吸附柱开盖离心2min，去除残留的乙醇。 1.2.8 Quick Change Quick Change即定点突变技术，是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。本实验的Quick Change按照Agilent Technologies公司的QuickChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒操作，该试剂工作的原理是：第一步是用标准的引物大量扩增，以及由Q5热启动高保真DNA聚合酶的混合；第二步是培育一种含有激酶、配体酶和DpnI的酶，这些酶一起使PCR产物快速循环，并将模板移除；最后一步再高效转化到感受态细胞中。操作步骤如下：在未修改核苷酸序列的两侧合成两条包含所需突变的互补核苷酸链；按照试剂盒中标注的体积加入缓冲液、DNA模板、两对引物、游离的脱氧核苷酸和去离子水，分别准备对照组和实验组；进行PCR循环，第一个循环设定为95℃30s，循环一次；之后进入95℃30s、55℃1min、68℃1.5min，12个循环；将反应体系放置在冰上2min，使反应冷却到37℃。 1.2.9 Blast Blast是一种基因分析技术，克隆完成的DNA拿去测序公司测序后会得到一长串的测序结果，将测序结果拿到分析网站基因库上进行blast，就可以得出实验中克隆的是哪种基因，以及它和其它种属之间的亲缘关系。 1.2.10 转染 (责任编辑：qin) |