CaSR介导色氨酸诱导猪胃胃肠激素分泌的规律(2)
时间:2018-08-01 14:29 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
色氨酸(Trp)不仅是人体必需氨基酸之一，也是猪的第四限制性必需氨基酸，国内外学者对其都有大量研究，发现色氨酸及其代谢产物5-羟色胺与动物采食量、免疫、抗应激等生理反应密切相关[4]。 钙(Ca)是机体内最重要的矿物元素之一，在各项生理活动中都处于必不可缺的地位，参与一切生命活动，例如文系细胞的正常生理功能，文持细胞膜两侧生物电位正常，文持神经及神经-肌肉传导功能和正常的肌肉伸缩与舒张功能。自Brown等[5]首次于牛甲状旁腺细胞中克隆出钙敏感受体（CaSR）后，在人的甲状旁腺和大鼠肾脏中也发现了CaSR的表达[6-8]， CaSR能被激活后，能够启动与其有关的信号通路，进一步调控细胞的增殖与分化和多种激素的分泌。 目前关于氨基酸和蛋白质对肠胃中CaSR的表达及影响方面的研究在家畜和其他动物上还比较少，对机体各项生命活动的调控作用也尚不明确。为此，本课题设计不同浓度色氨酸，通过不同条件的体外灌流实验，测定胃窦生长抑素、胃泌素分泌活性，揭示CaSR介导色氨酸诱导猪胃窦胃肠激素SS、gastrin分泌的规律 为后继续研究CaSR调节动物生理活动相关的机制及其发挥的生理功能奠定理论基础。 1 材料与方法 1．1 建立表面灌流系统 表面灌流装置参照谈寅飞[9]等人的方法并加以改进而成（如图1-1），该系统包括氧气瓶、储液瓶、恒流泵、灌流小室、恒温水浴锅、收集器、烧杯和硅胶管8个部分。 灌流小室（如图1-2）是由5mL的一次性注射器改装而成，包括尼龙网（400目）、针头、橡胶塞和注射器4个部分。  图1-1：灌流系统 Superfusion system 1.氧气瓶 Oxygen pump; 2. 储液瓶Media reservoir; 3.恒流泵 Peristaltic pump; 4.灌流小室 Chamber; 5.玻璃管 Glass tube; 6.水浴锅 Water bath; 7.收集器 Collector. 8.硅胶管Silicone tube 图1-2：灌流小室 Chamber 1． 尼龙网（400目）Nylon filter platform 2. 针头Needle3. 橡胶塞 Rubber stoper 4. 注射器Syringe 1．2 试剂和仪器 Kreb’s 培养液；色氨酸（Trp）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自Sigma-Aldrich（中国，上海）； cinacalcet和NPS2143均购自MedChem Express（中国，上海）；猪生长抑素SS（ANG-E31118P，AOGENE）、胃泌素gastrin（ANG-E31183P，AOGENE）ELISA试剂盒购自南京奥青生物技术有限公司（中国，南京）； pH计；酶标仪（Thermo，USA）；低温高速离心机（Eppendorf，Germany）。 1．3 样品处理 1．3．1 配置Kreb’s培养液 Kreb’s培养液(136.87 mM NaCl，4.02 mM KCl，2.10mM MgCl2，1.80 mM CaCl2，25.18mM HEPES，pH = 7.2）使用去离子水配置然后进行高压灭菌。各项试验均使用Kreb’s培养液作为基础液进行处理用作灌流液，分别按试验设计安排进行配制；对照组均使用Kreb’s培养液作为灌流液。 1．3．2 组织处理 将从屠宰场取来的新鲜胃组织剪取胃窦部分，于磷酸盐缓冲液(PBS)中洗去组织粘膜上附着物，剪碎，称量，用于后续灌流以及胃泌素、生长抑素分泌活性研究，将灌流前以及灌流后的组织置于冻存管中置于液氮中保存。 1．4 试验设计与样品收集 1．4．1 灌流实验 将洗净的胃组织全部剪成约1 mm2的组织块，混匀，称重，然后装入灌流小室中，每个灌流小室装400 mg。使用不含Trp的Kreb’s培养液进行预灌流，速度为6 mL/h，30分钟后使用刺激液进行灌流，并作为0 min，每隔20分钟收集一管灌流液，持续收集120分钟。在整个实验过程中，持续通入含5% CO2的O2，在灌流结束后，用-20℃和液氮保存所收集到的灌流液和胃窦组织块，待测。 (责任编辑：qin) |