赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆序列分析与时空表达特征鉴定(4)
时间:2018-09-18 20:45 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
表2 cDNA的合成体系 Table 2 Synthesis system of cDNA 消化后的RNA Primer Script RT Enzyme Mix I(3) RT Primer Mix(5) 5x Primer Script Buffer2(4) RNase Free H2O(6) 10.0μL 1.0uL 1.0uL 4.0uL 4.0uL Total Volume 20.0μL ②在PCR仪中，37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 10s； ③反转后的cDNA用ddH2O进行稀释，分别稀释到 5倍，10倍；再分别用内参基因Actin标定不同样品的cDNA浓度。 ④原液置于-40℃ 保存备用，稀释后的cDNA置于4℃ 短期保存。 1．2．2．3 引物设计 通过基因生物信息学分子中从NCBI下载的目标基因在葡萄中的基因序列，并分析获得其编码区，利用在线软件Primer3.0对编码区序列进行引物设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。具体序列见表3。 表3 PCR引物序列 Table 3 PCR Sequence of primers 基因 引物名称 引物序列 退火温度 VvAGL15 VvAGL15-F1 ATGGGACGTGGTAAGATTGAGA 60.0 VvAGL15-R1 TTTAACTGCCAGAGTTGTTGG 59.7 VvAGL23 VvAGL23-F1 ATGCTTTGTGTAGTGAACATGGGGAG 63.4 VvAGL23-R1 TTACCCGAGATGGAGGACCTTCTTAT 62.6 VvLEC1 VvLEC1-F1 ATGGAGACTGGAGGCTTCCA 60.3 VvLEC1-R1 TCATTTGTACTGGGCATATGGTTC 59.1 1．2．2．4 PCR扩增反应 以上述提取的cDNA为模板，进行目的基因的PCR扩增，具体体系如下表4。 表4 PCR反应体系 Table 4 Reaction system of PCR 试剂 使用量 cDNA 2μl PCR Forward Primer 1μl PCR Reverse Primer 1μl Buffer 2.5μl dNTP 0.5μl rRaq 0.2μl ddH2O 17.8μl Total 25μl反应程序：94℃， 5min； 94℃， 30S， 60℃， 30S， 72℃， 1min； 35 个循环后 72℃， 10 min；4℃保存。2%浓度琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。 1．2．2．5 PCR产物的回收 在切胶仪上切下 DNA 目的片段的凝胶块，使用上海捷倍思基因技术有限公司的试剂盒进行PCR产物回收，具体步骤详见产品使用说明。 (责任编辑：qin) |