应用蛋白质电泳技术检测杂交油菜种子的真实性和纯度(3)
时间:2018-10-13 09:30 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
4×分离胶缓冲液 18.17 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCI调整pH至8.8，定容至100 mL， 4℃保存。 4×浓缩胶缓冲液 6.06 g Tris，0.4 g SDS，加水溶解后用1 M HCl调整pH至6.8，定容至100 mL， 4℃保存。 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵，1 mL水，现配现用 10%TEMED 0.1 mL TEMED，0.9 mL水，4℃保存 蛋白提取液 50 Mm Tris-HCl，0.01 M 2-巯基乙醇，pH 8.0，4℃保存 4×样品缓冲液 2% SDS，0.1M Tris-HCl（pH8.0),0.01M 2-巯基乙醇，1g/L溴酚蓝，150g/蔗糖 电极缓冲液 0.025M Tris-HCl（pH8.3),0.192M甘氨酸，0.1%SDS 固定液 40%甲醇，10%乙酸，50%水 染色液 0.4 g考马斯亮蓝G250，40 g硫酸铵，8 mL磷酸，100 mL甲醇，定容至500 mL R250染色液 125 mL甲醇，50 mL乙酸，0.5 g考马斯亮蓝R250，溶解一夜后定容至500 mL 12.5% SDS-PAGE分离胶 15 mL分离胶缓冲液，25mL Arc-Bis，19mL蒸馏水，1mL10%过硫酸铵，20uL TEMED 5% DSD-PAGE 浓缩胶 10m浓缩胶缓冲液，6mLArc-Bis,24mL蒸馏水，0.36mL 10%过硫酸铵，90uLTEMED 1. 3. 2 蛋白样品的提取与准备 （1）将油菜种子碾碎，置于1.5 mL离心管中，加500µL蛋白提取液置于37℃摇床振荡2h； （2）振荡好后在4 ℃、12000 rpm条件下离心20 min，取上清液； （3）吸取20μL相同浓度的样品按4:1比例加入样品缓冲液； （4）样品充分涡旋混匀并煮沸3～5 min待用。 1. 3. 3 SDS-PAGE过程 （1）组装凝胶装置，按照说明书组装好灌胶模具，配置1.5%琼脂凝胶，封胶，注意不漏胶； （2）配置分离胶，加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀（过硫酸铵现配现用，操作时戴手套）； （3）小心将分离胶溶液灌入模具中（分离胶溶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm处）； （4）轻轻在分离胶缓冲液上均匀覆盖一层正丁醇压线，静置30 min，待分离胶凝固，同时配置浓缩胶备用； （5）倒去分离胶上的正丁醇并用蒸馏水缓慢冲洗两遍，用滤纸吸干胶面上的残留水分，灌入配置好的浓缩胶，插入梳子，静置20 min至浓缩胶凝固； （6）将电极缓冲液加入内外电泳槽中，小心拔出梳子，用细针将歪倒的胶拨正，用微量进样器赶走加样孔中的废胶和气泡； （7）将准备好的样品和蛋白Marker加入进样孔，接通电源，电泳条件开始设为恒压80V，待溴酚蓝带完全进入分离胶后，电压加倍； （8）当溴酚蓝带距玻璃板下沿1 cm处时结束电泳，取出凝胶并做好标记； （9）蒸馏水洗1～2次，室温摇床固定30min，弃去固定液，放入适量考马斯亮蓝R250或G250染色30 min～2 h（视具体染色情况而定），换上脱色液，摇动脱色至条带清晰； （10）将凝胶放入天根凝胶成像系统中拍照扫描，读胶。 1. 4 数据分析 根据电泳结果计算出每个品种迁移谱带的Rf值【11】,用0、1表示电泳条带的有无,在相同值位置上有蛋白质条带的记为1,而无带记为0。 (责任编辑：qin) |