水稻细菌性条斑病菌三个Xop基因功能研究相关载体的构建(2)
时间:2018-10-13 09:32 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1 材料与方法 1.1PCR扩增目的条带 扩增片段1： 240 xopAF pro -u（EcoRI）gaattcCGCCAGCTTCGCATCCA 241 xopAF pro -d（ApaI）gggcccGTGAGTCATTCATTGCCCAGT 240+241扩增片段大小：453bp 用途：扩增xopAF启动子，后反向连接到pHM1 lacZ 启动子下，消除pHM1 lacZ启动子的影响，xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达，观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达 扩增片段2： 242 xopAF pro- u（HindIII）aagcttCGCCAGCTTCGCATCCA 243 xopAF pro- d（NcoI）ccatggGTGAGTCATTCATTGCCCAGT 242+243扩增片段大小：453bp 用途：扩增xopAF启动子，后直接连接到1300NG载体，xopAF启动子融合gusA表达，瞬时转化烟草，观察xopAF启动子在植物中被诱导表达 扩增片段3： 244 xopAF pro+CDS-u(ApaI）gggcccCGCCAGCTTCGCATCCA 245 xopAF pro+CDS+flag-d(BglII)agatct TTA TCA CTT ATC GTC GTC ATC CT TGTA ATC ATCGCGGAGCTGCTCCGTA 244+245扩增片段大小1.3kb 用途：扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签，连接到PHM1，转入xopAF突变体，用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达 扩增片段4： 342xopAF pro+CDS-d (BglII)agatctATCGCGGAGCTGCTCCGTA 用途：244+342扩增xopAF启动子+编码区去掉终止密码子，便于同GFP,CYA做融合表达，检测蛋白分泌到植物细胞以及在植物细胞中的定位 扩增片段5： 246 xopAK pro-u（EcoRI）gaattcTCGGAAGACTGCCGGAGA 247 xopAK pro-d（ApaI）gggccc GGAGTCAGAACCGCCCG 246+247扩增片段大小：467 bp 用途：扩增xopAK启动子，反向连接到pHM1 lacZ 启动子下，消除pHM1 lacZ启动子的影响，xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达，观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达 扩增片段6： 248 xopAK pro-u（HindIII）aagcttTCGGAAGACTGCCGGAGA 249 xopAK pro-d（NcoI）ccatggGGAGTCAGAACCGCCCG 248+249扩增片段大小：467 bp 用途：扩增xopAK启动子，直接连接到1300NG载体，xopAK启动子融合gusA表达，瞬时转化烟草，观察xopAF启动子在植物中被诱导表达 扩增片段7： 250 xopAk pro+CDS-u（ApaI）gggccc CGGAAGACTGCCGGA250 251xopAk pro+CDS+flag-d(BglII)agatctTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC CCACGACTTGTAGTAATAGAT 250+251扩增片段大小：1.25kb 用途：扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签，连接到PHM1，转入xopAF突变体，用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达 扩增片段8： 343xopAk pro+CDS-d(BglII)agatctCCACGACTTGTAGTAATAGAT 用途：250+343去掉终止密码子，便于同GFP,CYA做融合表达 扩增xopAK启动子+编码区去掉终止密码子，便于同GFP,CYA做融合表达，检测蛋白分泌到植物细胞以及在植物细胞中的定位 扩增片段9： 252 Cya-u (ApaI) gggcccATGCAGCAATCGCATCAGG 253 Cya-d(BglII)agatctCTGGCGTTCCACTGCG 252+253扩增片段大小：1.2 kb 用途：扩增Cya编码区 扩增片段10： 266 GFP+-u(ApaI) gggcccATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT 267 GFP+-d (BglII) agatctTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC 252+253扩增片段大小：720bp 用途：扩增GFP编码区 扩增片段11： 259 XopAF orf-(SacI) gagctcATGGTGCCTGTTACCTACTATCAGAAAGC 462 XopAF orf-R(SalI) gtcgacTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCATCGCGGAGCTGCTCCGTA 259+462扩增片段大小：684bp 用途：扩增 XopAF编码区+flag，连接到载体P2300-d35S，编码区在双35S 启动子下超表达，注释烟草，用于通过OCTET(生物膜干涉检测)或Co-IP方法筛选互作蛋白 扩增片段12： 261 XopAK orf-F(SacI) gagctcATGAAGCCGGCTTGCATCA (责任编辑：qin) |