构建circRNA4235和circRNA4595转基因植物(3)
时间:2018-10-13 09:38 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
卡那霉素（kan）(50mg/ml)的)配制： (1)溶解500mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。 (2)分装成小份于-20℃储存。常以10ug/ml-50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 利福平（50 mg/ml）配制50ml： (1)称取2.5g 利福平置于50ml塑料离心管中。 (2)加入40mlDMSO，振荡充分混合溶解之后定容50ml，可以涡旋。 (3)用0.45um的细菌过滤器过滤，分装（1ml每管），置于-20℃储存。 2.实验方法 2.1植物材料培养 拟南芥在植物培养室培养，培养条件设置为：光照 10h，温度22℃，空气相对湿度 75％ ； 黑暗 14h，温度 22℃，空气相对湿度 75%。 2.2构建含有目的基因载体 2.2.1设计和合成引物 本实验使用Primer Premier软件，分别构建circRNA4235和circRNA4595基因过表达和突变型的上游和下游片段引物，由金斯瑞生物科技公司进行合成。 2.2.2拟南芥cDNA的获得[4]（突变体） 2.2.2.1拟南芥总RNA的提取： 操作步骤： (1)取0.1g4周的拟南芥叶片，在液氮中充分研磨后，加入1mlTrizol，使其充分裂解。可放置4℃ 冰箱； (2)12,000rpm 离心10min，弃沉淀； (3)按200ul氯仿，振荡混匀后室温放置5min； (4)4℃ 12,000rpm离心15min； (5)吸取上层水相500ul，至另一DEPC处理过的离心管中； (6)加入等体积水相的异丙醇，加入3M醋酸钠50ul,放置-20℃冰箱中过夜沉淀； (7)4℃ 12,000g离心20min，弃上清； (8)按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； (9)4℃ 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。 (10)超净台中吹5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解； (11)加30ul DEPC处理过的H2O； (12)测RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.8-2.0之间； 2.2.2.2反转录得到cDNA 用随机引物反转录得到cDNA，RNA浓度为1ug/ul,反转录体系为20ul. (责任编辑：qin) |