不同叶龄玉米叶片对DNA质量的影响和条件优化(4)
时间:2016-11-12 20:38 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
（4）6500rpm离心30min，去上清液并转移到另一支离心管中； （5）重复3、4步骤； （6）向上清液中加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置30min； （7）沉淀用75%乙醇漂洗2次，每次12000rpm 2min,取沉淀弃上清； （8）晾干后，加入40μLTE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。 2.5.2 SDS法（十二烷基苯磺酸钠法）提取DNA （1）将玉米叶片洗净，用75%的乙醇在其表面消毒，用去离子水冲洗3次。取玉米不同叶龄叶片1g于研钵中，用液氮研磨成粉末，将粉末迅速转移到离心管中； （2）加入适量预热至65℃的SDS提取缓冲液，轻轻震荡摇匀，加入20% SDS溶液，摇匀，于65℃热水浴中保温30min，不时摇动； （3）加入5MKAc(1/10V)，混匀，冰浴20min，然后离心，取上清液转入另一离心管中； （4）加入等体积氯仿-异戊醇溶液（24:1；V/V），轻轻颠倒混匀，离心取上清液； （5）加入预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，于-20℃静置30min沉淀核酸； （6）离心，取沉淀弃上清，用70%乙醇漂洗沉淀2次； （7）晾干DNA,溶于TE缓冲液，4℃保存备用。 2.6指标测定方法 2.6.1紫外-可见分光光度计检测 取适量DNA用TE缓冲液稀释后，以TE缓冲液作为对照组。用紫外-可见分光光度计测定其在230nm、260nm和280nm处的吸光度OD230、OD260和OD280。由此可得：1、DNA纯度用 OD260/ OD280、OD260/ OD230来表示（若OD260/ OD280接近1.8，OD260/ OD230接近2.0，则DNA纯度符合标准）；2、DNA浓度(μg/ml )= OD260×50μg/ml×稀释倍数；3、DNA产率(μg/g)= DNA浓度(μg/ml) ×最终DNA体积（ml）/材料鲜重（g）。 2.6.2琼脂糖凝胶电泳检测 取3μg玉米DNA，于0.7%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为5V/㎝，电泳后用凝胶成像系统成像拍照。检测提取的DNA分子量大小和条带的清晰度，由此可检测出玉米DNA样品的纯度，看其检测结果与紫外-可见分光光度计的检测结果是否一致。 3.结果与分析 3.1不同方法提取玉米不同叶龄叶片的DNA的紫外吸光值比较 采用CTAB和SDS两种方法对玉米的幼苗、幼嫩叶、成熟叶进行了DNA提取。对提取的DNA进行紫外吸光值进行测定，结果如下表。从吸光值可看出本文来自优尔/文(论"文?网，毕业论文 www.youerw.com 加7位QQ324~9114找原文，提取DNA的产率，幼苗和幼嫩叶差别不大，产率较高，成熟叶的产率较低。两种提取方法比较，CTAB比SDS提取的DNA质量高。所以，最适的提取材料是幼苗和幼嫩叶，最适的提取方法是CTAB。 (责任编辑：qin) |