绵羊胃肠道组织中miR-1197的表达差异性研究(2)
时间:2018-12-16 17:36 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
MiRNA在动物体内的合成方式已得到相关实验的研究和证实。首先，RNA聚合酶II催化miRNA的基因转录生成初级miRNA，初级miRNA又会被Drosha和DGCR8酶切割成前体miRNA，而前体miRNA在被转运蛋白exportin5由细胞核转运至细胞质后又会被Dicer酶剪切成双链miRNA，然后双链会解链为单链，单链成熟miRNA能够与RNA诱导沉默复合体结合形成miRNP复合体，最后mRNA基因水平上的调节就是由miRNA和RISC的复合体—miRNP介导的，利用miRNA上的序列与mRNA的3′UTR不完全互补结合识别，降解mRNA来抑制靶基因的表达[3]。 MicroRNAs（miRNAs）是一种小的，类似于但不同于siRNA的分子，siRNA是在RNAi过程中形成的中间体，是在人工插入或病毒感染dsDNA时形成的，主要来源于转基因或病毒RNA，而且siRNA主要是以双链形式存在,其3′端存在两个非配对的通常为UU的碱基，siRNA与靶mRNA可以完全互补配对结合，因此siRNA的靶序列如果有一个核苷酸突变，就会影响到RNAi的沉默效应，siRNA主要在转录后水平通过RNAi途径发挥作用。与siRNA不同的是，miRNA则是细胞内RNA的固有成分之一，主要来源于内源转录本，是由具有发夹结构的pre-miRNA转变而来的，而且其主要是以单链形式存在，miRNA能够与靶mRNA以不完全形式互补,因此存在错配现象，靶mRNA如果有一个位点发生突变现象，虽然miRNA就是不完全识别的,但也不会影响到miRNA途径的调节效应，miRNA主要是在蛋白质水平通过miRNA途径发挥作用[4]。 由有关文献可知[5]，miRNA能够参与乳腺、肌肉、皮肤毛囊的发育和具有繁殖的机能，虽然这是一篇关于山羊的文献，但我们仍可以猜测在绵羊上miRNA同样具有相同或者相似的功能。 本实验研究的是miR-1197在绵羊不同组织中的表达，miR-1197是miRNA的一种，它是位于18号染色体由真核基因编码的miRNA，长度为129bp，其序列为 GAGGCGAGGTCGGCATCCCTTCCTGGTATTTGAAGACGCGGTTGACCATGGTGTGTACGCTTT ATTTATGACGTAGGACACATGGTCTACTTCTTCTCGATATCACATCTTCGCCTTGGAAGACCTTCC[6]。 本实验旨在通过运用real-time PCR方法来检测miR-1197在绵羊10种肠胃组织中的差异性表达情况，为后续研究及探讨miR-1197与各组织器官的发育、分化、功能文持及与疾病发生之间的关系极其发生机制提供前期实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本 产地于徐州的湖羊。 1.1.2 仪器及试剂 超低温冰箱（美国Thermo），超净工作台，单人净化工作台，液氮罐，研钵，移液枪，高速台式冷冻离心机，电子天平，台式高速离心机，掌上离心机，NANODROP2000C spectrophotometer (美国Thermo)，PCR仪(Thermal cycler)，微波炉，电泳仪，凝胶成像分体系统及转印槽，实时荧光定量PCR仪（BioSoar），直冷式冷藏冷冻箱（SIEMENS）,LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，卧式冷柜（Haier），冰盒，干燥箱；酒精，液氮，RNAIiosplus,氯仿，异丙醇，乙醇，5×gDNA Eraser Buffer ,gDNA Eraser ,RNA ,RNase Free dH2O，Prime Script R-T Enzyme Mix1，5×Prime Script Buffer2(for realtime),R-Tprimer ,18s-rRNA primer ,RNase Free dH2O ，2×Taq Master Mix(Dye plus),miR-1197PF16引物GPRb引物，cDNA,水（PCR）,琼脂糖，0.5×TBE 缓冲液，gelview核酸染料，SYBR Premix Ex Taq（Ⅱ）（2×）(Tli RNase H plus),Rox Reference Dye(50×),miR-1197RT8引物，18s-bPF 引物，18s-bPR 引物。 (责任编辑：qin) |